多糖合劑的制備及體外間接抗腫瘤活性

葉伶艷,任 明,呂 琳,李 麗,齊燕飛,李 娟,徐 坤

(吉林大學公共衛生學院衛生檢驗學教研室,吉林長春 130021)

多糖合劑的制備及體外間接抗腫瘤活性

葉伶艷,任 明,呂 琳,李 麗,齊燕飛,李 娟,徐 坤

(吉林大學公共衛生學院衛生檢驗學教研室,吉林長春 130021)

目的:分別從人參、松茸和香菇中提取分離人參多糖(GPS)、松茸多糖(PTM)和香菇多糖(PLE), 對GPS、PTM和PLE進行分析鑒定并制備合劑,探討3種多糖不同比例合劑體外間接抗腫瘤活性。方法:采用水提醇沉法提取分離3種多糖,采用苯酚-硫酸法測定總多糖水平,間羥基聯苯法測定糖醛酸水平,國標法測定淀粉水平,應用光譜法和化學法對3種多糖進行分析鑒定。采用正交試驗法研究3種多糖的最佳配比。通過細胞毒性T淋巴細胞(CTL)實驗,采用LDH釋放法檢測GPS、PTM和PLE組成的多糖合劑對CTL殺傷活性的影響及對小鼠肥大細胞瘤P815細胞間接殺傷作用。結果:GPS、PTM和PLE的提取率分別為8.85%、9.40% 和10.50%,總多糖水平分別為62.96%、59.13%和33.86%,糖醛酸水平分別為16.44%、9.37%和4.77%,淀粉水平分別為7.26%、2.80%和3.77%。光譜法和化學法鑒定,提取到的物質為多糖。3種多糖質量配比為1∶1∶1、濃度為600 mg·L－1時,CTL殺傷活性最強。結論:獲得3種多糖化合物,并進行了表征和鑒定,多糖合劑能夠增強CTL殺傷活性,對小鼠肥大細胞瘤P815細胞的增殖具有間接抑制作用。

人參多糖;松茸多糖;香菇多糖;多糖合劑;抗腫瘤活性

腫瘤是當前嚴重危害人類健康的重大疾病之一,常用的抗腫瘤化學治療藥物不良反應較大,且療效并不理想,因此尋找效果優良且不良反應較小的抗腫瘤藥物是目前醫學界研究的熱點。多糖因其不良反應小且具有多種藥理作用而受到人們的廣泛關注,近年來研究[1-3]表明:多糖具有抗腫瘤、腫瘤輔助治療、增強機體免疫力、抗病毒、抗氧化、降血糖和降血脂的作用。

人參多糖(ginseng polysaccharide,GPS)、松茸多糖(polysaccharides of tricholoma matsutake, PTM)和香菇多糖(polysaccharide of lentinus edodes,PLE)單獨使用均有輔助腫瘤治療及增強免疫力作用,但作用機制不完全相同[4-7]。目前對多糖合劑抗腫瘤作用的研究報道較少,國內有研究[1]表明:多糖復合抗腫瘤作用效果優于單味多糖,具有顯著的抗腫瘤、提高免疫功能的作用,且不同多糖之間的藥理作用呈現協同性。為了闡明GPS、PTM和PLE合劑的體外間接抗腫瘤活性,本實驗以人參、松茸和香菇為原料,提取多糖,對3種多糖分析鑒定,并研究3種多糖不同比例合劑對細胞毒性T淋巴細胞(CTL)殺傷活性的影響及對小鼠肥大細胞瘤P815增殖的間接抑制作用,為其臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料、標準品和實驗動物人參產地為吉林省長白山地區,松茸和香菇產地為黑龍江省伊春市康寶山,經吉林大學公共衛生學院衛生檢驗學教研室鑒定為人參、松茸和香菇。人參多糖標準品(吉林省宏久生物科技股份有限公司,批號:070602-D),松茸多糖標準品(南京澤朗醫藥科技有限公司,批號:ZL20110316),香菇多糖標準品(南京澤朗醫藥科技有限公司,批號:111109)。實驗用健康C57小鼠,動物合格證號:SCXK(吉2007-0003),由吉林大學基礎醫學院實驗動物中心提供。小鼠肥大細胞瘤P815細胞株由吉林大學基礎醫學院饋贈。

1.2 多糖的提取分離按文獻[4-9]采用水提醇沉法提取分離3種多糖。GPS:料液比1∶20; PTM:料液比1∶30;PLE:料液比1∶30,提取溫度100℃,提取3次,每次2 h,過濾,濾液10 000 r·min－1離心5 min,取上清液,加4倍體積95%乙醇,4℃醇沉過夜,抽濾,沉淀依次用無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌,干燥,稱質量。

1.3 3種多糖中成分水平測定粗多糖中總多糖水平采用苯酚-硫酸比色法[10]和紫外可見分光光度計進行測定。多糖中糖醛酸水平按文獻[11]采用間羥基聯苯法測定。多糖中淀粉經過預處理后,按文獻[11]還原糖的測定方法DNS比色法進行測定。

1.4 粗多糖的精制按文獻[12-13]采用Sevage法除去粗多糖中蛋白,采用氧化法(H2O2法)脫色素。

1.5 鑒 定紅外光譜分析:10 mg樣品與溴化鉀壓片,在4 000～500 cm－1范圍內進行掃描,與購買的標準品[14-15]進行對照。Fehling實驗:供試品溶液酸水解,調p H為中性,加入等量的堿性酒石酸銅溶液,沸水浴10 min,觀察溶液的變化。Molish實驗:取供試品溶液適量,加入10% α-萘酚乙醇溶液2～3滴,搖勻,沿試管壁滴加濃硫酸,觀察溶液的變化。

1.6 多糖合劑的制備及CTL殺傷活性檢測選擇GPS、PTM和PLE 3種多糖,以CTL殺傷活性為依據,采用L9(34)正交實驗法對3種多糖的復合組方[16]進行研究。見表1。無菌取出小鼠脾臟,將其磨碎,過200目細胞篩,氯化氨裂解紅細胞后, PBS洗3次,離心棄上清。加入含10%FBS的RPMI-1640培養基制備脾淋巴細胞懸液,將多糖與淋巴細胞共同孵育24 h,用培養液調整細胞濃度為1×107m L－1,分離脾細胞,將脾細胞懸液加入96孔板中,每孔100μL。以小鼠肥大細胞瘤P815細胞作為檢測CTL殺傷活性的靶細胞,按照效靶比20∶1設殺傷實驗孔,同時設有靶細胞自然釋放孔和最大釋放孔,每孔均設3個復孔。于CO2培養箱中共培養24 h后,收集細胞上清液,加入LDH試劑,待反應完全后,檢測490 nm處的吸光度(A)值[1-4]。細胞殺傷活性＝(實驗釋放孔A值－自發釋放孔A值)/(最大釋放孔A值－自發釋放孔A值)×100%。

表1 3種多糖正交實驗因素水平分布表Tab.1 Factors and levels of orthogonal test of three kinds of polysaccharides[ρB/(mg·L－1)]

2 結果

2.1 粗多糖的提取率及3種多糖成分水平3種粗多糖GPS、PTM和PLE的提取率分別為8.85%、9.40%和10.5%。3種多糖GPS、PTM 和PLE中總多糖水平分別為62.96%、59.13%和33.86%,糖醛酸水平分別為16.44%、9.37%和4.47%,淀粉水平分別為7.26%、2.80%和3.77%。

2.2 3種多糖的紅外圖譜分析3種多糖的紅外圖譜與標準品的圖譜吸收峰大體位置相同,在3 500、3 000和1 700 cm－1附近有明顯的吸收峰, 3 500 cm－1左右出現的強寬峰為糖O-H伸縮振動的強吸收;3 000 cm－1左右的吸收峰為C-H伸縮振動產生;1 700 cm－1左右的吸收峰為-CHO以及糖醛酸殘基上的-COOH的C＝O伸縮振動造成,這一區域的吸收峰是糖類的特征吸收峰。見圖1～3。

2.3 Fehling實驗分析Fehling實驗結果顯示:樣品溶液產生棕紅色的氧化亞銅沉淀,表明有多糖存在。

2.4 Molish實驗分析Molish實驗結果顯示:樣品溶液分層,在兩界面處產生紫色環,表明有多糖的存在。

2.5 3種多糖合劑組方體外間接抗腫瘤正交實驗經極差分析,3種多糖在合劑中主次順序為PTM、GPS和PLE。根據K1、K2和K3確定最優組合為A3B3C3,即3種多糖濃度均為200 mg·L－1時,CTL殺傷活性最高,能有效地抑制小鼠肥大細胞瘤P815細胞的增殖。見表2。

圖1 GPS紅外光譜圖Fig.1 IR chromatogram of GPSA:Extraction of GPS;B:Standard of GPS.

圖2 PTM紅外光譜圖Fig.2 IR chromatogram of PTMA:Extraction of PTM;B:Standard of PTM.

圖3 PLE紅外光譜圖Fig.3 IR chromatogram of PLEA:Extraction of PLE;B:Standards of PLE.

表2 3種多糖合劑組方CTL殺傷活性正交實驗結果Tab.2 Results of orthogonal test of CTL cytotoxicities of three kinds of polysaccharides complex

3 討論

多糖的提取方法有水提取法、酸堿提取法、醇提取法、酶法、微波提取法、超聲提取法、超濾法、超臨界萃取法和雙水相萃取法等,近年來超濾法、雙水相萃取法和超臨界萃取法等逐漸引起研究者的關注。熱水提取法是多糖工業化生產最常用的方法之一,且不需要特殊的設備、簡單、方便、無污染、成本低,故本實驗采用熱水提取法[8]。多糖水平的測定有蒽酮-硫酸法、地衣酚-硫酸法和苯酚-硫酸法等,本實驗采用苯酚-硫酸法測定總多糖水平,操作簡單,顯色穩定[10]。咔唑-硫酸法和間羥基聯苯法用于測定糖醛酸水平,與其他方法不同,間羥基聯苯法不受共存的中性已糖和戊糖的干擾,簡便、快速、靈敏[11-12]。本研究采用國標法檢測淀粉水平,Sevage法除蛋白,氧化法脫色素,光譜法和化學法相結合分析鑒定,證實提取物為多糖。

本研究采用LDH法以CTL殺傷活性為指標,以小鼠肥大細胞瘤P815細胞為靶細胞,篩選3種多糖合劑的最佳組合,正交實驗結果表明:3種多糖中PTM占主導地位,3種多糖組成的合劑質量配比為1∶1∶1、濃度為600 mg·L－1時,CTL殺傷活性最強,間接抗腫瘤效果最好。

綜上所述,GPS、PTM和PLE組成的多糖合劑增強了CTL殺傷活性,對小鼠肥大細胞瘤P815細胞增殖有間接抑制作用。

[1]劉吉成,蘇富琴,趙學梅.復合多糖抗腫瘤后增效作用研究[J].中藥藥理與臨床,2006,12(3/4):73-76.

[2]趙錫民.中醫藥防治腫瘤的研究[J].長春中醫藥大學學報, 2012,29(1):169-170.

[3]謝好貴,韋明釬,陳美珍,等.復合多糖體外抗腫瘤協同增效作用初步研究[J].食品科學,2013,34(15):1-10.

[4]Zhang X,Yu L,Bi HT,et al.Total fractionation and characterization of the water-soluble polysaccharides isolated from Panax ginseng C.A.Meyer[J].Carbohydrate Polymer,2009,77(3):544-552.

[5]宋利華,蕭 偉,鹿麗麗,等.正交試驗優選人參多糖的提取工藝[J].中草藥,2012,43(2):283-287.

[6]劉 剛,王 輝,郭成希,等.正交實驗法優選松茸多糖的提取工藝[J].中國藥師,2009,12(7):914-915.

[7]王美珠,曹月坤,韓秋菊.兩種方法提取香菇多糖的比較研究[J].氨基酸與生物資源,2012,34(2):51-52.

[8]黃小葳.多糖的非常規提取研究[J].北京聯合大學學報, 2011,25(1):59-63.

[9]Ding X,Zhu FS,Gao SG.Purification,antitumour andimmunomodulatory activity of water-extractable and alkaliextractable polysaccharides from Solanum nigrum L[J].Food Chemistry,2012,131(2):677-684.

[10]鐘方曉,任海華,李 巖.多糖水平測定方法比較[J].時珍國醫國藥,2007,18(8):1916-1917.

[11]夏永剛,梁 軍,楊炳友,等.麻黃多糖中糖醛酸水平的測定[J].中醫藥,2011,39(1):71-73.

[12]張惟杰.糖復合物生化研究技術[M].浙江:浙江大學出版社,2006.

[13]于 雷,王保奇,張華峰,等.首烏藤多糖脫色脫蛋白純化工藝研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2012,23(2):215-219.

[14]Shang MS,Zhang XM,Dong Q,et al.Isolation and structural characterization of the water-extractable polysaccharides from Cassia obtusifolia seeds[J].Carbohydrate Polymer,2012,90(2):827-832.

[15]周寶珍,肖婭萍,牛俊峰.絞股藍多糖的分離純化及紅外光譜、氣相色譜分析[J].中華中醫藥雜志,2012,27(1): 97-100.

[16]劉 萍,閆素清,柴保臣,等.四種真菌多糖復合組方的篩選[J].鄭州大學學報:醫學版,2009,44(2):430-432.

Preparation of polysaccharide complex and its indirect antitumor activity in vitro

YE Ling-yan,REN Ming,LYU Lin,LI Li,QI Yan-fei,LI Juan,XU Kun
(Department of Health Laboratory,School of Public Health,Jilin Univeisity,Ghangchun 130021,China)

ObjectiveTo extract the Ginseng polysaccharide(GPS),polysaccharides of Tricholoma matsutake (PTM)and polysaccharide of Lentinus edodes(PLE)from gingeng,tricholoma matsutake and lentinus edodes respectively,and to analyze and identify their structures,and to prepare their complex,and to study the indirect antitumor activity in vitro of polysaccharide complex.MethodsThe polysaccharides were extracted with hot water and precipitated by ethanol.The carbohydrate levels were determined by the method of phenol-sulfuric acid.The mhydroxyphenyl method was used to determine the levels of uronic acid,and the national standard method was used to determine the levels of starch.Infrared spectroscope and chemical methods were performed to analyze their structures.Orthogonal experiment was used to study mixing methods.Cytotoxic T lymphocyte experiment and LDH release assay were performed to detect the influence of polysaccharide complex of GPS,PTM,and PLE in the CTL killing activity,and its indirect killing effect on the P815 cells.ResultsThe extraction rates of GPS, PTM,and PLE were 8.85%,9.40%,and 10.50%;the levels of total polysaccharides were 62.96%,59.13%, and 33.86%;the levels of uronic acid were 16.44%,9.37%,and 16.44%;the starch levels were 7.26%,2.80%,and 3.77%,respectively.The identification results showed that the polysaccharides were obstrained.When the quality ratio of the three kinds of polysaccharides was 1∶1∶1 and the concentration was 600 mg·L－1, the CTL cytotoxicity was the highest.ConclusionThe polysaccharide complex is obtained,identified and characterized.Polysaccharide complex can enhance the cytotoxicity of CTL and has the indirectly inhibitory effect on the proliferation of P815 cells.

Ginseng polysaccharide;polysaccharides of Tricholoma matsutake;polysaccharide of Lentinus edodes; polysaccharide complex;antitumor activity

R273

A

2014-01-25

吉林省科技廳科研基金資助課題(20130522056JH);吉林省科技廳醫藥產業發展專項資金項目資助課題(yyzx201123-2)

葉伶艷(1989－),女,河北省唐山市人,在讀醫學碩士,主要從事多糖合劑保健品的抗腫瘤作用研究。

李 娟(Tel:0431-85645486,E-mail:li_juan＠jlu.edu.cn); 徐 坤(Tel:0431-85619455,E-mail:xukun＠jlu.edu.cn)

1671-587Ⅹ(2014)05-1033-05

10.13481/j.1671-587x.20140525