殼層隔絕納米粒子增強拉曼光譜檢測乳腺浸潤性導管癌組織的生物學特點及其臨床意義

張海鵬,吳 迪,張 湜,付 彤,路 璐,范志民,鄭 超,韓 冰

(1.吉林大學第一醫院產科,吉林長春 130021;2.吉林大學第一醫院乳腺外科,吉林長春 130021)

殼層隔絕納米粒子增強拉曼光譜檢測乳腺浸潤性導管癌組織的生物學特點及其臨床意義

張海鵬1,吳 迪2,張 湜?,付 彤2,路 璐2,范志民2,鄭 超2,韓 冰2

(1.吉林大學第一醫院產科,吉林長春 130021;2.吉林大學第一醫院乳腺外科,吉林長春 130021)

目的:采用殼層隔絕納米粒子增強拉曼光譜(SHINERS)技術檢測乳腺浸潤性導管癌(IDC)組織和正常乳腺組織,探討乳腺IDC的光譜學特點、生物學特征和鑒別方法。方法:收集行乳腺外科手術患者的乳腺組織冰凍切片,共24例,均為女性,年齡27～59歲;其中乳腺IDC組織15例,正常乳腺組織9例。冰凍切片解凍后先行普通拉曼光譜檢測,加殼層隔絕納米粒子(SHINs)后再次檢測。共收集了263個拉曼光譜和249個SHINERS光譜,所有光譜均進行基線修正擬合,再將所有的光譜用Adjacent-Averaging算法進行15點平滑。結果:正常乳腺組織特征峰出現在1 090、1 157、1 262、1 300、1 442、1 658、1 745和1 874 cm－1;在加入SHINs后,少數特征峰的峰位出現2～3 cm－1位移,其中1 090和1 157 cm－1相對強度明顯增加,出現1 496 cm－1特征峰。乳腺IDC組織普通拉曼光譜檢測可見多個核酸特征峰(包括878、1 086和1 157 cm－1);加入SHINs后,明顯看到1 004、1 157、1 526和1 658 cm－1相對強度增加,脂類的特征峰1 745和1 442 cm－1為C＝O和CH2伸縮振動,IDC組織相對于正常組織表現出2～3 cm－1的藍移;類胡蘿卜素的特征峰出現在1 527 cm－1;核酸的特征峰1 090 cm－1藍移至1 086 cm－1。結論:拉曼光譜能夠發現乳腺IDC組織DNA、蛋白質及類胡蘿卜素與正常乳腺組織的差異。SHINERS對不同類型的乳腺組織最大增強的特征峰不同,可以用來區分乳腺IDC組織和正常乳腺組織。

乳腺腫瘤;拉曼光譜;表面增強拉曼光譜;浸潤性導管癌

拉曼光譜分析技術是以拉曼效應為基礎建立起來的分子結構表征技術,其信號來源于分子的振動和轉動[1],拉曼光譜分析在生物學領域研究中的突出優點使其成為近年來應用最多的一種研究手段。拉曼光譜的分析方法不需要對樣品進行前處理,操作簡便,測定時間短,靈敏度高,有利于臨床即時檢測;拉曼光譜檢測后的組織仍可以進行病理學檢查,有利于檢測結果與病理結果的對比研究[2-3]。但由于生物樣品的拉曼譜峰具有強的熒光背景和復雜的成分等特點,得到質量高可分析的拉曼譜圖相對比較困難。田中群等[4]合成了一種全新的增強粒子——殼層隔絕納米粒子(SHINs),發明了基于表面增強拉曼光譜的一種新技術,即殼層隔絕納米粒子增強光譜(SHINRES)方法,并將其應用于生物樣本的檢測,取到很好的效果,目前國內外尚無將該方法應用于乳腺病變組織檢測的相關報道。本研究采用SHINRES方法檢測乳腺浸潤性導管癌(IDC)組織和正常乳腺組織,通過拉曼光譜結果的差異探討乳腺IDC光譜學特點,為鑒別病變性質和進一步研究病變機制奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2011年5月—2012年5月吉林大學第一醫院乳腺外科手術患者的乳腺組織冰凍切片,共24例,均為女性,年齡27～59歲;其中乳腺IDC組織15例(年齡31～74歲,中位年齡51.6歲),正常乳腺組織9例(年齡27～59歲,中位年齡40.3歲)。所有患者均同意參加本研究。手術后,樣本立即送至吉林大學第一醫院病理科,并在－25℃～－20℃條件下冰凍,而后通過冷凍切片機(LEICA-CM3050S,德國)切成6μm厚連續冰凍切片。每個患者均切取1個樣本且每個樣本僅切取2張冰凍切片。其中1張連續冰凍切片經HE染色后由1位乳腺癌病理學專家進行常規組織病理學診斷;另一張連續冰凍切片在液氮中送往實驗室。分析之前,冰凍切片在實驗室室溫22℃下解凍10 min,光譜采集期間用生理鹽水(p H7.4)保持濕潤。每張切片均收集多個光譜,但由于一些腫瘤組織樣本切片中含有正常和病變區域,因此本研究利用已染色的HE組織病理學切片,只收集病變區域的光譜數據。本文作者收集數據的組織樣本切片中的確切區域,在進行病理診斷時以其最高級定義。

1.2 拉曼光譜檢測使用具有3λ空間分辨率、20 m W、633 nm的氦氖激光作為激發光的共聚焦拉曼系統收集拉曼光譜。拉曼散射光的收集使用50倍顯微鏡物鏡用于激發光的聚焦。激光聚焦在組織上的光斑大小為2μm。強烈的瑞利散射光被4-notch過濾器過濾。掃描光譜范圍為600～2 000 cm－1,積分時間為60 s,累積次數為3次。波數校準設置參照硅片520.7 cm－1振動頻率。所有的光譜測量均保持這些設置。

1.3 數據采集從HE染色切片中找到腫瘤位置,收集其連續冰凍切片中相同位置的拉曼光譜。每個樣品中從不同位置收集10～12個光譜,以確保代表性取樣和收集變化的信號。收集普通拉曼光譜后,將SHINs(由廈門大學田中群院士課題組提供)滴加到冷凍切片的表面,之后收集SHINERS光譜。共收集了來源于不同組織的263個拉曼光譜和249個SHINERS光譜,其中正常乳腺組織共收集103個拉曼光譜和92個SHINERS光譜,乳腺IDC組織共收集160個拉曼光譜和157個SHINERS光譜。

1.4 統計學分析所有光譜均進行基線修正擬合,再減去一個三階多項式。將所有光譜用Adjacent-Averaging算法進行15點平滑。

2 結果

觀察正常乳腺組織冰凍切片的普通拉曼光譜和SHINERS的平均光譜圖(圖1,見插頁五)以及相應的HE染色(圖2A,見插頁五)、冰凍切片(圖2B,見插頁五)和滴加SHINs后的病理學圖像(圖2C,見插頁五),普通拉曼光譜可見特征峰出現在1 090、1 157、1 262、1 300、1 442、1 658、 1 745和1 874 cm－1,其中大多數為脂類特征峰和蛋白質,如膠原蛋白的特征峰。加入SHINs后,由于所處環境的改變,少數特征峰的峰位會有2～3 cm－1位移,其中1 090和1 157 cm－1相對強度明顯增加,出現1 496 cm－1特征峰,這3個特征峰歸屬為脂類和核酸中的O-P-O和C-C鍵。

觀察乳腺IDC組織冰凍切片的普通拉曼光譜和SHINERS的平均光譜圖(圖3,見插頁五)以及相應的HE染色(圖4A,見插頁五)、冰凍切片(圖4B,見插頁五)和滴加SHINs后的病理學圖像(圖4C,見插頁五),普通拉曼光譜可見有多個核酸特征峰(包括878、1 086和1 157 cm－1),通過蛋白質特征峰可見大量的氨基酸殘基(色氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸)。加入SHINs后,明顯看到1 004、1 157、1 526和1 658 cm－1相對強度增加。各特征峰歸屬見表1。

表1 正常乳腺組織和乳腺IDC組織拉曼光譜特征峰的歸屬Tab.1 Assignments of special peaks of Raman spectra of normal breast tissue and breast IDC tissue

對于脂類的特征峰,1 745和1 442 cm－1左右為C＝O和CH2伸縮振動,乳腺IDC組織相對于正常組織表現出2～3 cm－1的藍移;類胡蘿卜素的特征峰出現在1 527 cm－1;核酸的特征峰中, 1 090 cm－1藍移至1 086 cm－1。蛋白和核酸特征峰增強前后光譜峰的比值見表2。其中1 262、1 445和1 748 cm－1為脂類的特征峰,1 004和1 658 cm－1為蛋白質的特征峰,880、1 086和1 157 cm－1為核酸的特征峰。

表2 正常乳腺組織和乳腺IDC組織中脂類、蛋白和核酸的特征峰增強前后的光譜絕對峰值比值Tab.2 Ratios of absolute values of spectrum of characteristic peaks of lipid,protein and nucleic acid before and after enhancement in normal breast tissue and breast IDC tissue

3 討論

拉曼光譜對水環境干擾小。可以從分子水平反映結構組分的變化和差異,是一種具有高靈敏度的無損檢測方法。拉曼光譜的激發波長和激光能量密度不破壞組織,并且有相對大的穿透深度,所以適合進行體內檢測[5-6]。在病變的初期拉曼光譜即可發現其分子細微的生物學組分改變[7],可用于腫瘤的早期診斷,因而顯示其具有廣泛的應用前景。對于正常乳腺組織,在加入SHINs后,由于所處環境的改變,少數特征峰的峰位發生2～3 cm－1位移,其中1 090和1 157 cm－1相對強度明顯增加,并出現了新的特征峰,即1 496 cm－1,這3個特征峰可歸屬為脂類和核酸中的O-P-O和C-C 鍵,由此可以推斷出SHINs對上述2種化學鍵有明顯的增強作用。本研究在其他特征峰中, 1 262 cm－1為蛋白質的三級結構中的酰胺Ⅲ和酰胺Ⅰ,未觀察到非常明顯的核酸特征峰,可見正常乳腺組織中細胞比較完整,代謝及復制、轉錄和翻譯等分裂過程正常,未出現病變無限制繁殖及凋亡現象。

本研究結果顯示:在乳腺IDC組織普通光譜中可以看到多個核酸特征峰(878、1 086和1 157 cm－1),而蛋白質特征峰則均可見大量的氨基酸殘基(色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸)[8-9],可能因其惡性病變后細胞非正常的分裂繁殖,使氨基酸殘基逐漸增多,這是細胞的非正常代謝所導致的直接結果[10-11];在加入SHINs后,可明顯看到1 004、1 157、1 526和1 658 cm－1相對強度增加,這些特征譜線可歸屬為氨基酸殘基苯丙氨酸、類胡蘿卜素、核酸中的嘌呤和酰胺Ⅰ。在正常組織中,酰胺Ⅰ特征譜線比較明顯,在惡性病變中卻觀察不到酰胺Ⅰ特征譜線,但經過SHINs增強,可以觀察到比較明顯的特征譜線,所以可以推斷在惡性病變中存在酰胺Ⅰ帶特征峰。對于脂類的特征峰, 1 745和1 442 cm－1左右為C＝O和CH2伸縮振動,乳腺IDC組織相對于正常組織表現出2～3 cm－1的藍移,該變化可能由于細胞癌變過程中脂質過氧化導致[12];而就蛋白特征峰而言, 665 cm－1歸屬于氨基酸的C-S伸縮振動,只出現在IDC組織中;類胡蘿卜素的特征峰,1 527 cm－1C＝C伸縮振動只有在IDC組織中表現的比較明顯,在其他組織中幾乎觀察不到。Shafer-Pelitier 等[11]在其所建立的人乳腺組織顯微光譜模型中觀察到類胡蘿卜素未顯示出或顯示較小的特異性,并不能被視為區分正常、良性和惡性乳腺組織的標志,而本研究結果表明:類胡蘿卜素的拉曼光譜是惡性腫瘤表現出的關鍵特征。核酸的特征峰中,1 090 cm－1左右是DNA的磷酸骨架伸縮振動譜線,一旦DNA發生單、雙鏈的斷裂,該譜線強度下降并會發生位移。乳腺IDC組織中該峰藍移至1 086 cm－1,說明在癌變組織中部分DNA的單雙鏈已開始斷裂。比較正常乳腺組織和乳腺IDC組織的普通拉曼光譜特征可以發現:其光譜特征表現出很大的相似性,可能由于2種組織主要的化學成分相同,主要為脂類、蛋白質、核酸和胡蘿卜素。同時,2種乳腺組織的普通拉曼光譜表現出一些差異,可以為區分乳腺組織提供一種手段。但由于乳腺組織本身具有強的熒光背景和復雜的化學成分,再加上普通拉曼光譜其靈敏度低,有時很難得到乳腺組織的普通拉曼光譜。因此,為了獲得更詳細和有效的信息來區分2種乳腺組織,本文作者利用SHINs增強得到了SHINERS,將其與普通拉曼光譜對比顯示:拉曼信號強度得到了一定的增強,說明SHINERS可以為區分乳腺疾病提供更有效的信息。

為了利用SHINERS進一步區分2種乳腺組織,本研究采用SHINs對各個組織的主要化學成分包括脂質、蛋白和核酸特征峰的具體增強效果進行比較。SHINs對不同乳腺組織的同類特征峰表現出了不同程度的增強。脂類的特征峰中,正常乳腺組織的1 745 cm－1左右C＝O伸縮振動增強效果最明顯,1 262 cm－1左右＝C-H平面振動增強效果最差。而乳腺IDC組織中,SHINs對1 442 cm－1脂類的CH2伸縮振動增強效果最強,對1 262和1 748 cm－1的增強效果相似。根據表面選擇性規則,垂直于金屬基底表面的振動模式能得到很大的增強,而平行于金屬基底表面的振動模式增強較小[4,13-14]。由此可以推斷:在正常乳腺組織和乳腺IDC組織中,脂類的C＝O伸縮振動垂直吸附于SHINs表面,＝C-H平面振動可能平行吸附于SHINs表面,而導致出現不同程度的增強效果。SHINs對2種組織的1 658 cm－1蛋白質的酰胺Ⅰ帶和α-螺旋均表現出較強的增強效果,卻對正常組織中1 004 cm－1的苯丙氨酸對稱環伸縮振動[15]表現出減弱的作用,對乳腺IDC組織的該特征峰表現出一定的增強作用。事實上,苯丙氨酸一直被認為是細胞增殖不受控制的標志,其廣泛存在于纖維腺瘤中的膠原纖維形成及腫瘤癌變增殖等過程,在此表現出的增強效果的差異尚需進一步研究。

核酸不僅是重要的基本遺傳物質,而且在合成蛋白質的過程中還起著重要的作用,SHINs對正常乳腺組織中核酸的各個特征峰增強效果類似,而對于乳腺IDC組織,880 cm－1表現出比較強的增強效果。SHINs對每種組織均有1個特征峰的最大增強。在乳腺IDC組織中,880 cm－1歸屬于DNA的核糖的特征峰得到了最大程度的增強,其增強倍數為10。而對于正常乳腺組織得到最大增強的是1 745 cm－1左右脂類C＝O伸縮振動峰,其增強倍數僅為3.5。

本研究結果顯示:SHINs對乳腺組織的增強效果并不是特別好,可能是由于SHINs作為SHINERS增強基底,增強機制主要為電磁場增強,而電磁場增強涉及的分子與金屬的作用為物理吸附[4,13-14],乳腺組織的成分比較復雜,表面不能很好地吸附納米粒子,使分子不能很好地吸附在納米粒子周圍而影響了其增強效果,使其低于文獻報道的SiO2層為2和4 nm時,可分別增強142和85倍。但是對拉曼光譜的最大增強效果仍舊可以達到10倍左右,這在一定程度上可以提高拉曼光譜對乳腺組織檢測的靈敏度。

綜上所述,拉曼光譜可以在分子水平上反映乳腺組織生化成分的結構變化和差異,為乳腺疾病的診斷提供了一種有效的光譜手段。拉曼光譜能夠發現乳腺IDC組織DNA、蛋白質及類胡蘿卜素與正常乳腺組織之間的差異,為癌變機制研究提供一種可能方法。SHINs對不同類型的乳腺組織最大增強的特征峰不同,可以用來區分乳腺IDC和正常乳腺組織。

[1]Tu Q,Chang C.Diagnostic applications of Raman spectroscopy[J].Nanomedicine,2012,8(5):545-558.

[2]張海鵬,付 彤,宋 東,等.殼層隔絕納米粒子增強光譜方法檢測乳腺導管內癌組織的生物學特性[J].吉林大學學報:醫學版,2014,40(2):374-378.

[3]張海鵬,付 彤,張志茹,等.應用PCA方法分析拉曼光譜檢測結果對乳腺良惡性疾病鑒別診斷的價值[J].吉林大學學報:醫學版,2013,39(5):952-957.

[4]Li JF,Huang YF,Ding Y,et al.Shell-isolated nanoparticle-enhanced Raman spectroscopy[J].Nature, 2010,464(7287):392-395.

[5]Stone N,Matousek P.Advanced transmission Raman spectroscopy:a promising tool for breast disease diagnosis[J].Cancer Res,2008,68(11):4424-4430.

[6]Matousek P,Stone N.Recent advances in the development of Raman spectroscopy for deep non-invasive medical diagnosis[J].J Biophotonics,2013,6(1):7-19.

[7]Hu C,Wang J,Zheng C,et al.Raman spectra exploring breast tissues:Comparison of principal component analysis and support vector machine-recursive feature elimination[J].Med Phys,2013,40(6):063501.

[8]Haka AS,Shafer-Peltier KE,Fitzmaurice M,et al.Diagnosing breast cancer by using Raman spectroscopy[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(35):12371-12376.

[9]Haka AS,Shafer-Peltier KE,Fitzmaurice M,et al.Identifying microcalcifications in benign and malignant breast lesions by probing differences in their chemical composition using Raman spectroscopy[J].Cancer Res,2002, 62(18):5375-5380.

[10]Yuen JM,Shah NC,Walsh JT,et al.Transcutaneous glucose sensing by surface-enhanced spatially offset Raman spectroscopy in a rat model[J].Anal Chem,2010, 82(20):8382-8385.

[11]Shafer-Peltier KE,Haka AS,Fitzmaurice M,et al.Raman microspectroscopic model of human breast tissue:implications for breast cancer diagnosisin vivo[J].J Raman Spectrosc, 2002,33(7):552-563.

[12]Abramczyk H,Placek I,Brozek-Pluska B,et al.Human breast tissue cancer diagnosis by Raman spectroscopy[J].Spectrosc-Int J,2008,22(2/3):113-121.

[13]Li JF,Tian XD,Li SB,et al.Surface analysis using shellisolated nanoparticle-enhanced Raman spectroscopy[J].Nat Protoc,2013,8(1):52-65.

[14]Anema JR,Li JF,Yang ZL,et al.Shell-isolated nanoparticle-enhanced Raman spectroscopy:expanding the versatility of surface-enhanced Raman scattering[J].Annu Rev Anal Chem(Palo Alto Calif),2011,4:129-150.

[15]Marcelo M,Leandro R,Emília Angelo Loschiavo A,et al.Raman spectroscopy study of breast disease[J].Theor Chem Acc,2009,125(3-6):329-334.

?吉林大學臨床醫學院2012級

Biological characteristics of breast invasive ductal carcinoma detected by shell-isolated nanoparticleenhanced Raman spectroscopy and their clinical significances

ZHANG Hai-peng1,WU Di2,ZHANG Shi?,FU Tong2,LU Lu2,FAN Zhi-min2,ZHENG Chao2,HAN Bing2
(1.Department of Obstetrics Surgery,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China; 2.Department of Breast Surgery,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo identify normal breast tissue and breast invasive ductal carcinoma(IDC)tissue by shellisolated nanoparticle-enhanced Raman spectroscopy(SHINERS),and to explore the biological characteristics of IDC and the identification method by discussing its spectroscopy characteristics.MethodsThe frozen section of breast tissue from 24 patients(female,aged 27－59 years)underwent routine surgical resection were obtained.9 cases of normal breast tissue and 15 cases of IDC breast tissue were detected by Raman spectroscopy and thenSHINERS technique was utilized.A total of 263 Raman spectra and 249 SHINERS spectra were obtained.All the spectra were dealt with baseline corrected by fitting and subtracting a third-order polynomial and then smoothed with a 15-point Adjacent-Averaging.ResultsThe characteristic peak of normal breast tissue appeared at 1 090,1 157, 1 262,1 300,1 442,1 658,1 745,and 1 874 cm－1.After adding shell-isolated nanoparticles(SHINs),some peaks shifted at 2－3 cm－1,and the relative strengthes of 1 090 and 1 157 cm－1were significantly increased,and the characteristic peak at 1 496 cm－1appeared.The Raman spectroscopy showed there were more nucleic acid characteristic peaks(including 878,1 086,1 157 cm－1)in the breast IDC tissue;after adding SHINs,the relative strengthes of 1 004,1 157,1 526,and 1 658 cm－1were increased,the characteristic peak of lipid at 1 745 cm－1and 1 442 cm－1stemmed from the C＝O and CH2 stretching vibration.Compared with the normal breast tissue, the breat IDC tissue showed a blue shift of 2－3 cm－1.The characteristic peaks of nucleic acid had the blue shift from 1 086 cm－1to 1 090 cm－1,and the characteristic peak ofβ-carotene emerged at 1 527 cm－1.ConclusionRaman spectra can discover the differences of the characteristic peaks of DNA,β-carotene,and protein between breast IDC and normal breast tissues;SHINERS can distinguish breast IDC tissue from normal breast tissue successfully.

breast neoplasms;Raman spectroscopy;surface enhanced Raman spectroscopy;invasive ductal carcinoma

R737.9

A

2014-02-10

國家自然科學基金青年基金資助課題(81202078);吉林省科技廳科技發展計劃青年基金資助課題(20130522030JH);吉林省科技廳科研基金資助課題(201015155)

張海鵬(1980－),女,吉林省長春市人,主治醫師,在讀醫學博士,主要從事生物拉曼光譜的研究。

韓 冰(Tel:0431-81875672,E-mail:yintian77＠126.com);

付 彤(Tel:0431-88782963,E-mail:xxli＠jlu.edu.cn)

1671-587Ⅹ(2014)05-1064-05

10.13481/j.1671-587x.20140530