凝血酶原基因G20210A突變檢測(cè)對(duì)肺血栓栓塞癥的預(yù)測(cè)價(jià)值

張 佳,趙鳳芹,譚 平,季 紅

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院呼吸內(nèi)科,吉林長春 130033;2.北京航天中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,北京 100049; 3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院藥品管理部,吉林長春 130033)

凝血酶原基因G20210A突變檢測(cè)對(duì)肺血栓栓塞癥的預(yù)測(cè)價(jià)值

張 佳1,2,趙鳳芹1,譚 平1,季 紅3

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院呼吸內(nèi)科,吉林長春 130033;2.北京航天中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,北京 100049; 3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院藥品管理部,吉林長春 130033)

目的:探討凝血酶原基因G20210A(FⅡG20210A)突變?cè)谥袊鴸|北地區(qū)肺血栓栓塞癥(PTE)患者中的發(fā)生頻率,闡明檢測(cè)該突變基因?qū)χ袊鴸|北地區(qū)人群PTE的預(yù)測(cè)價(jià)值。方法:選擇經(jīng)核素肺灌注顯像和(或)螺旋CT肺動(dòng)脈造影(CTPA)結(jié)合臨床癥狀確診的PTE患者60例(病例組)和同期來自相同地區(qū)、性別和年齡相匹配的正常健康人80名(對(duì)照組)。應(yīng)用蛋白酶消化及乙醇抽提獲得2組研究對(duì)象的DNA。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、Hin dⅢ限制性內(nèi)切酶片段多態(tài)性分析(RFLP)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)病例組和對(duì)照組研究對(duì)象FⅡG20210A基因突變情況。結(jié)果:經(jīng)Hin dⅢ酶切后,病例組僅出現(xiàn)407和99 bp 2個(gè)條帶,FⅡG20210A突變頻率為0%,與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);病例組和對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)FⅡG20210A基因雜合子或純合子突變。結(jié)論:FⅡG20210A基因突變?cè)谖覈鴸|北地區(qū)PTE患者中發(fā)生率低,FⅡG20210A基因突變檢測(cè)可能對(duì)中國東北地區(qū)人群PTE無預(yù)測(cè)價(jià)值。

肺血栓栓塞癥;G20210A基因;凝血酶原

肺血栓栓塞癥(pulmonary thromboembolism, PTE)是由來自右心或靜脈系統(tǒng)的血栓阻塞肺動(dòng)脈或其分支所致的疾病,是肺栓塞中最常見的類型,以肺循環(huán)和呼吸功能障礙為主要臨床表現(xiàn)和病理生理特征。過去一直認(rèn)為PTE是一種少見病,隨著診療水平的不斷提高,人們逐漸認(rèn)識(shí)到PTE是一種常見病和多發(fā)病,每年發(fā)生率已達(dá)1‰～2‰[1-3],美國統(tǒng)計(jì)PTE在心血管疾病中的發(fā)病率僅次于冠心病與高血壓。由于PTE臨床表現(xiàn)不典型,從毫無癥狀到猝死差異顯著,我國PTE存在嚴(yán)重的確診延誤、誤診及漏診狀況,影響了PTE患者的預(yù)后,對(duì)人們的生命及健康造成了嚴(yán)重的威脅。因此,提高PTE的早期診斷水平對(duì)改善PTE患者的預(yù)后有重要意義。近年來,凝血酶原基因G20210A(FⅡG20210A)突變被認(rèn)為是新發(fā)現(xiàn)的血栓性疾病的遺傳危險(xiǎn)因素之一,攜帶FⅡG20210A突變者可以使血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)增加2倍以上[5-6]。但是,對(duì)該基因突變的研究,大多集中于美國和歐洲等白種人,對(duì)亞洲等地的非白種人研究較少。而且有研究[7]顯示:在日本PTE患者中未發(fā)現(xiàn)FⅡG20120A突變;在約旦進(jìn)行的有關(guān)研究[8]也提示FⅡG20210A突變?cè)赑TE患者中發(fā)生率很低,該基因突變與PTE發(fā)生無明顯相關(guān)性;在我國有關(guān)PTE與FⅡG20210A突變的相關(guān)性研究較少,而東北地區(qū)PTE與FⅡG20210A突變相關(guān)性研究尚未見報(bào)道。本研究應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)140例東北地區(qū)PTE患者和健康對(duì)照者FⅡG20210A基因突變位點(diǎn),比較PTE患者與正常人群FⅡG20210A基因突變的發(fā)生率,探討檢測(cè)上述基因突變是否對(duì)中國東北地區(qū)人群PTE具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值,進(jìn)一步研究中國東北地區(qū)人群PTE的遺傳機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2011年6月—2013年6月在吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院就診的PTE住院患者60例(病例組),其中男性28例,女性32例,年齡21～83歲,平均年齡(52.52±13.46)歲。選擇同期來自本院體檢中心體檢者及健康志愿者80名(對(duì)照組),其中男性38名,女性42名。年齡22～81歲,平均年齡(52.13±11.70)歲。病例組和對(duì)照組研究對(duì)象均為在吉林省居住5年及5年以上的常住居民。病例組和對(duì)照組性別構(gòu)成和年齡構(gòu)成分析顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn):60例PTE患者的診斷均依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的《肺血栓栓塞癥診斷和治療指南(草案)》制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9],均經(jīng)核素肺灌注顯像和(或)螺旋CT肺動(dòng)脈造影(CTPA)發(fā)現(xiàn)充盈缺損并結(jié)合臨床癥狀確診。排除標(biāo)準(zhǔn):①分娩過程中及分娩后出現(xiàn)肺栓塞;②長骨骨折、嚴(yán)重脂肪組織挫傷或脂肪擠壓傷患者并發(fā)肺栓塞;③腫瘤患者并發(fā)肺栓塞。對(duì)研究對(duì)象遵循醫(yī)學(xué)倫理學(xué)一般原則,尊重其知情同意權(quán)、隱私權(quán)、保密權(quán)和自主權(quán),通過倫理委員會(huì)審查。

1.2 DNA制備抽取每例研究對(duì)象靜脈血2 m L,放于EDTA抗凝管中。常規(guī)經(jīng)蛋白酶消化及乙醇抽提DNA。DNA試劑提取盒由美國Qiagen公司提供。提取出的基因組DNA于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR引物合成PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,凝血酶原基因引物為:引物1,5′-GCACAGACGGCTGTTCTCTT-3′,引物2,5′-ATAGCACTGGGAGCATTGAAGC-3′[10]。

1.4 PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系總體積為50μL,其中包括:Ta KaRa Premix Taq 25μL,引物1和引物2各2μL,基因組DNA 4μL, d H2O 17μL;用Eppendorf公司的PCR擴(kuò)增儀對(duì)凝血酶原基因的相關(guān)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s, 72℃延伸30 s,循環(huán)35次;72℃延伸5 min。產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳,采用美國Alpha Imager EC凝膠成像分析系統(tǒng)分析。根據(jù)DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)擴(kuò)增條帶的大小,確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段是否為目的DNA片段。

1.5 限制性內(nèi)切酶酶切對(duì)確認(rèn)擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物,采用Hin dⅢ進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)(大連寶生物公司),反應(yīng)總體積為20μL。酶切反應(yīng)體系: Hin dⅢ1μL,10×M Buffer 2μL,PCR產(chǎn)物10μL,d H2O 7μL,混勻,37℃酶切過夜。

1.6 瓊脂糖凝膠電泳分析取酶切產(chǎn)物10μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行照相分析。結(jié)果以凝膠成像分析系統(tǒng)照相分析所得的基因片段表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。病例組和對(duì)照組基因型頻數(shù)分布以百分率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物鑒定對(duì)照組和病例組研究對(duì)象的DNA均擴(kuò)增出1條506 bp片段,與預(yù)期的片段大小相符。見圖1。

2.2 Hin dⅢ酶切PCR產(chǎn)物結(jié)果判定正常野生型(無突變基因者G/G),只有407和99 bp 2個(gè)條帶;基因突變雜合子G/A,Hin dⅢ酶切后PCR產(chǎn)物電泳出現(xiàn)407、384、99和23 bp 4個(gè)條帶;基因突變純合子A/A,Hin dⅢ酶切PCR產(chǎn)物電泳出現(xiàn)384、99和23 bp 3個(gè)條帶。經(jīng)酶切后,病例組及對(duì)照組均只有407和99 bp 2個(gè)條帶,未發(fā)現(xiàn)基因純合子及雜合子突變。

2.3 FⅡG20210A的突變頻率60例PTE患者和80名正常人凝血酶原基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Hin dⅢ酶切后均出現(xiàn)2條DNA帶(407和99 bp),未顯示其他條帶,說明PCR擴(kuò)增序列只有1個(gè)酶切位點(diǎn),不存在由于基因突變導(dǎo)致的Hin dⅢ酶切位點(diǎn)。提示病例組和對(duì)照組FⅡG20210A的突變頻率為0%。見圖2和表1。

圖1 FⅡG20210A基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoregram of PCR amplification products of FⅡG20210AM:DNA marker;Lane 1－12:PTE group;Lane 13－21:Control group.

3 討論

圖2 FⅡG20210A基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Hin dⅢ酶切電泳圖Fig.2 Electrophoregram of PCR amplication product of F ⅡG20210A gene digested by Hin dⅢM:DNA marker;Lane 1－13:PTE group;Lane 14－24:Control group.

表1 2組研究對(duì)象FⅡG20210A基因型頻數(shù)分布Tab.1 Distribution of genotypic frequencies of FⅡG20210A in objects in two groups[n(η/%)]

1996年,荷蘭人Poort等[11]應(yīng)用人工合成引物直接測(cè)序的方法發(fā)現(xiàn)FⅡG20210的基因位置在m RNA前體3′端未翻譯區(qū)域末尾裂解位點(diǎn)或其附近,該位置鳥嘌呤突變?yōu)橄汆堰?G→A),稱為FⅡG20210A突變。突變后可能會(huì)上調(diào)m RNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平,或使纖溶受抑,導(dǎo)致凝血酶原水平升高,凝血相對(duì)增強(qiáng),進(jìn)而增加了靜脈血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。隨后,世界各地逐漸對(duì)該基因突變進(jìn)行了深入研究。Fineschi等[12]研究發(fā)現(xiàn):40例PTE患者中,有10例(25%)攜帶有FⅡG20210A突變,而正常對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)該突變基因,說明FⅡG20210A突變對(duì)PTE的發(fā)生有較高預(yù)測(cè)價(jià)值。Nagorni-Obradovic等[13]發(fā)現(xiàn):1例D-二聚體陰性的PTE患者FⅡG20210A突變陽性,說明該突變基因可能為PTE的一個(gè)遺傳危險(xiǎn)因子。除FⅡG20210A突變外,凝血因子ⅤLeiden(FⅤL)突變也是血栓形成的重要遺傳因素。國外研究[11]發(fā)現(xiàn):若同時(shí)攜帶FⅡG20210A突變和FⅤL可使靜脈血栓栓塞癥(venous thromboembolism, VTE)的風(fēng)險(xiǎn)增加20～30倍。PTE的高危因素包括遺傳性(原發(fā)性)和獲得性(繼發(fā)性),獲得性高危因素包括口服避孕藥、肥胖、高齡和近期手術(shù)等,若FⅡG20210A突變并發(fā)PTE獲得性高危因素,可使PTE患病風(fēng)險(xiǎn)更高。Delluc等[14]研究發(fā)現(xiàn):體質(zhì)量指數(shù)(BMI)升高和FⅡG20210A突變同時(shí)存在可使VTE的風(fēng)險(xiǎn)提高12倍。

FⅡG20210A突變的分布具有明顯的地域性和種族之間的差異,在北歐和南歐有2%～6%的VTE患者攜帶有FⅡG20210A基因突變,而中東及非洲則少見,在美國的白種人中,該基因突變發(fā)生率約為2.5%,而在非白種人中非常少見。FⅡG20210A突變?cè)趤喼薜难芯恐幸鄻O為罕見。Angchaisuksiri等[15]在有關(guān)泰國人FⅡG20210A突變的研究中發(fā)現(xiàn):在500名健康對(duì)照者中僅發(fā)現(xiàn)0.2%突變基因攜帶者,50例深靜脈血栓(DVT)患者中未發(fā)現(xiàn)該基因突變。在有關(guān)中國人的研究[16-17]中,分別涉及山東和北京等地區(qū),發(fā)現(xiàn)FⅡG20210A突變基因檢出率為0%;畢云天等[18]發(fā)現(xiàn):FⅡG20210A突變?cè)贒VT病例組中發(fā)生率明顯高于正常對(duì)照組;鄭紅等[19]報(bào)道:中國正常人群出現(xiàn)FⅡG20210A基因突變。

目前國內(nèi)外的研究大多是關(guān)于FⅡG20210A突變與VTE的相關(guān)性,關(guān)于該基因突變與PTE的相關(guān)性研究較少,針對(duì)東北地區(qū)人群的相關(guān)研究未見報(bào)道。本研究采用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)東北地區(qū)人群中PTE患者凝血酶原基因是否存在G20210A突變的位點(diǎn),并尋找攜帶該基因突變的其他特點(diǎn),結(jié)果顯示:60例PTE患者和80名正常人凝血酶原基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均不存在由于基因突變導(dǎo)致的Hin dⅢ酶切位點(diǎn),未發(fā)現(xiàn)FⅡG202010A突變基因,與國內(nèi)其他地區(qū)及亞洲大多數(shù)研究結(jié)果相一致,但是本研究結(jié)果與歐美國家有關(guān)白種人的研究結(jié)果并不一致,究其原因,可能與以下幾方面因素有關(guān):①國外研究[20-21]認(rèn)為FⅤL雖然是VTE較強(qiáng)的易感因子,但與PTE可能無關(guān),而對(duì)于FⅡG20210A突變,也有可能存在與VTE和PTE相關(guān)性的差別。在我國及泰國發(fā)現(xiàn)FⅡG20210A基因突變分別存在于DVT患者及健康對(duì)照者中[13,17],而PTE患者中并未發(fā)現(xiàn);②本研究樣本數(shù)較少,也可能有該基因突變尚未發(fā)現(xiàn);③本研究結(jié)果與亞洲及國內(nèi)大多數(shù)研究結(jié)果一致,該基因突變?cè)趤喼藜胺前追N人中發(fā)生率低,而在歐美白種人中發(fā)生率較高,進(jìn)一步證明該基因突變存在顯著的地域和種族差異;④本研究病例組均為PTE患者,而國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道研究對(duì)象大多為VTE患者,可能FⅡG202010A突變是DVT的易感因子,但與PTE無明顯相關(guān)性。

本組研究對(duì)象均為中國東北地區(qū)人群,無論病例組還是對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)FⅡG20210A突變,說明FⅡG20210A突變檢測(cè)對(duì)中國東北地區(qū)人群PTE早期診斷可能無預(yù)測(cè)價(jià)值,本研究樣本數(shù)較少,也可能有該基因突變尚未發(fā)現(xiàn),并不能完全說明該基因突變與東北地區(qū)人群PTE發(fā)生無關(guān),尚需擴(kuò)大樣本例數(shù)進(jìn)一步研究。另外,凝血酶原基因上是否存在其他突變位點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。

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Predictive value of prothrombin G20210A mutation detection in pulmonary thromboembolism

ZHANG Jia1,2,ZHAO Feng-qin1,TAN Ping1,JI Hong3
(1.Department of Respiratory Medicine,China-Japan Union Hospital,Jilin University,Changchun 130033, China;2.Department of Intensive Care Unit,Aerospace Center Hospital,Beijing 100049,China;3.Department of Drug Administration,China-Japan Union Hospital,Jilin Uninversity,Changchun 130033,China)

ObjectiveTo study the incidence frequency of prothrombin G20210A(FⅡG20210A)mutation in the patients with pulmonary thromboembolism(PTE)in northeast China,and to clarify the predictive value of FⅡG20210A mutation detection in PTE of the population in northeast China.Methods60 PTE patients(PTE group) and 80 sex-matched healthy controls(control group)from the same geographic area were selected.All the patients were diagnosed by lung ventilation/perfusion scan and/or multi-slice CT pulmonary angiography(CTPA)as well as medical history.The genome DNA was extracted from the whole blood using alcohol.Polymerase chain reaction (PCR),restriction fragment length polymorphisms(RFLP)analysis with Hin dⅢrestriction enzyme and sepharose gel electrophoresis were used to identify the FⅡG20210A mutation in PTE group and control group.ResultsAfter digested by Hin dⅢrestriction enzyme,only the fragments of 407 and 99 bp were found in PTE group.The frequency of FⅡG20210A mutation was 0%,there was no statistical difference compared with contol group(P＞0.05).There were no heterozygote and homozygote mutation of FⅡG202210A gene in PTE group and control group.ConclusionThe incidence of FⅡG20210A mutation in the PTE patients in northeast China is verylow,and the detection of FⅡG20210A mutation may have no predictive value in PTE of the population in northeast China.

pulmonary thromboembolism;G20210A gene;prothrombin

R563.5

A

2013-12-16

吉林省科技廳科研基金資助課題(201115092)

張 佳(1988－),女,河南省開封市人,醫(yī)學(xué)碩士,主要從事重癥醫(yī)學(xué)方面的研究。

趙鳳芹(Tel:0431-84995860,E-mail:cczfq＠163.com); 季 紅(Tel:0431-84995145,E-mail:1215834671＠qq.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-1080-05

10.13481/j.1671-587x.20140533