PI3K特異性抑制劑LY294002增強rsTRAIL蛋白對A549細胞的殺傷作用

劉 磊,方艷秋,齊亞靈,蘆小單,魏海峰,譚 巖

(1.吉林省人民醫院腫瘤生物治療中心,吉林長春 130021; 2.佳木斯大學基礎醫學院組織學與胚胎學教研室,黑龍江佳木斯 154007)

PI3K特異性抑制劑LY294002增強rsTRAIL蛋白對A549細胞的殺傷作用

劉 磊1,方艷秋1,齊亞靈2,蘆小單1,魏海峰1,譚 巖1

(1.吉林省人民醫院腫瘤生物治療中心,吉林長春 130021; 2.佳木斯大學基礎醫學院組織學與胚胎學教研室,黑龍江佳木斯 154007)

目的:探討磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)參與非小細胞肺癌A549細胞株抵抗重組可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(rs TRAIL)蛋白誘導凋亡的機制,尋找增強rs TRAIL蛋白殺傷非小細胞肺癌細胞的新方法。方法:選取對數生長期A549細胞,隨機分為rs TRAIL蛋白組和PI3K特異性抑制劑LY294002聯合rs TRAIL蛋白(LY294002＋rs TRAIL蛋白)組。MTT法檢測2組A549細胞生長抑制率,流式細胞技術檢測2組A549細胞周期和細胞凋亡的變化,蛋白質印跡法檢測2組A549細胞中p-Akt(Ser473)、c-FLIPL、Bcl-2和Bax蛋白表達水平。結果:與rs TRAIL蛋白組(5.16%±0.32%)比較,LY294002＋rs TRAIL蛋白組A549細胞生長抑制率(74.6%±2.63%)明顯升高(P＜0.05)。與rs TRAIL蛋白組比較,LY294002＋rs TRAIL蛋白組處理2 h后G0/G1期A549細胞百分比增加(P＜0.05),S期細胞百分比降低(P＜0.05)。LY294002＋rs TRAIL蛋白組A549細胞凋亡率為(61.50±3.02)%,顯著高于rs TRAIL蛋白組(3.21%±0.96%)(P＜0.05)。蛋白質印跡檢測,與rs TRAIL蛋白組比較,LY294002＋rs TRAIL蛋白組A549細胞中p-Akt、c-FLIPL和Bcl-2蛋白表達水平降低(P＜0.05),Bax/Bcl-2比值升高(P＜0.05)。結論:LY294002能夠抑制PI3K活性,增強rs TRAIL蛋白對A549細胞的殺傷作用。

癌,非小細胞肺;A549細胞株;腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體;磷脂酰肌醇3激酶;LY294002

肺癌是目前世界上嚴重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤,發病率呈明顯上升趨勢,全球每年有超過百萬人死于肺癌,其中85%死于非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。研究肺癌的發生、發展以及轉移的分子機制,探索有效的靶向治療手段具有重要的臨床意義[1]。腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)是一種天然的殺傷腫瘤細胞因子,被證實是唯一具有對正常組織細胞無毒性的抗腫瘤因子[2]。研究[3]顯示:TRAIL可以抑制體外培養的NSCLC細胞增殖和SCID小鼠體內NSCLC細胞的生長。本文作者[4-5]獲得的重組可溶性TRAIL(rs TRAIL)蛋白在抗NSCLC的應用研究中展現出了良好的抗腫瘤活性,然而腫瘤細胞內某些蛋白的異常表達和活化可以抑制TRAIL誘導的腫瘤細胞凋亡的發生,影響其在臨床研究中的廣泛應用。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白酶B(PI3K/Akt)信號轉導通路的活化在人類惡性腫瘤中非常普遍, PI3K/Akt調控失調參與NSCLC細胞存活、增殖、抗凋亡和血管生成的各個環節,中斷PI3K/Akt信號轉導通路的轉導可以增強藥物對腫瘤細胞誘導凋亡的敏感性[6-7]。本研究選用PI3K特異性抑制劑LY294002對PI3K/Akt信號轉導進行干預,觀察參與TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡過程的c-FLIPL、Bcl-2和Bax蛋白表達的變化及A549細胞凋亡和增殖情況,探討PI3K/Akt通路在NSCLC抵抗TRAIL耐藥中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑A549細胞由吉林省人民醫院中心實驗室傳代保存。rs TRAIL蛋白由吉林大學第一醫院中心實驗室表達純化[2]。IMDM培養基、胰蛋白酶(美國Gibco公司),小牛血清(杭州四季青生物材料公司),四甲基偶氮唑藍(MTT)(美國Sigma公司),LY294002(美國Calbiochem公司),抗p-Akt(Ser473)、抗Bcl-2、抗c-FLIPL、抗β-actin一抗和HRP標記抗鼠IgG或抗兔IgG二抗均為美國Cell Signaling Technology產品,細胞周期和細胞凋亡檢測試劑盒購于貝克曼庫爾特商貿有限公司。

1.2 MTT法檢測細胞生長抑制率選取對數生長期的A549細胞,調濃度為5×105m L－1,接種于96孔板,每孔100μL。細胞貼壁后分別采用rs TRAIL蛋白(100 mg·L－1)作用12 h和20μmol·L－1LY294002作用不同時間(2、4、8 和16 h),再應用rs TRAIL蛋白(100 mg·L－1)作用12 h,每組設3個平行孔,每孔加入新配制的5 g·L－1MTT 20μL,37℃繼續孵育4 h,棄上清后加150μL DMSO溶解,混勻后在490 nm波長處測定吸光度(A)值,計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率＝(1－實驗組A值/對照組A值)× 100%。

1.3 流式細胞術檢測細胞周期選取對數生長期的A549細胞,調整濃度為5×105m L－1,接種于6孔板,每孔1 m L,待其生長至80%匯合時,采用20μmol·L－1LY294002作用1 h,收取單細胞懸液,用預冷的PBS洗滌2次,并用預冷的乙醇固定于4℃冰箱保存。PI染液(500μL/管),避光靜置30 min后采用流式細胞儀檢測細胞周期,分析各周期細胞百分率。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡選取對數生長期的A549細胞,調整濃度為5×105m L－1,接種于6孔板,每孔1 m L,待其生長至80%匯合時,采用20μmol·L－1LY294002作用2 h,加入100μg·L－1的rs TRAIL蛋白處理12 h,收取3孔細胞。同時以rs TRAIL蛋白單獨處理組作為對照組。獲得的單細胞懸液用PBS洗滌2次, Annexin-Ⅴ/FITC與PI匹配標記細胞,流式細胞術測定細胞凋亡率。

1.5 Western blotting法檢測p-Akt、c-FLIPL、Bcl-2和Bax蛋白表達水平選取對數生長期的A549細胞,調整濃度為5×105m L－1,并接種于6孔板,每孔1 m L,待其生長至80%匯合時, 20μmol·L－1LY294002作用2 h,加入100μg·L－1rs TRAIL蛋白處理12 h,收取3孔細胞。同時以rs TRAIL蛋白單獨處理組做為對照。收取細胞并采用裂解液獲取總蛋白,測定各組細胞蛋白水平并將蛋白樣品濃度調整為40 g·L－1。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜2 h,10%脫脂奶封閉作用1 h。棄去封閉液,加入用封閉液稀釋的一抗工作液(抗p-Akt、c-FLIPL、Bcl-2和Bax及抗β-actin抗體),4℃振搖孵育過夜。TBST洗膜3次,加入1∶3 000稀釋的相應二抗,室溫反應1 h;TBST洗膜3次,增強化學發光試劑顯色,采用BandScan 5.0分析軟件進行灰度分析,以目的蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.6 統計學分析采用SPSS 10.0統計學軟件進行統計處理。細胞生長抑制率、各細胞周期A549細胞所占百分率、A549細胞凋亡率及p-Akt、c-FLIPL、Bcl-2和Bax蛋白表達水平以±s表示,組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 2組A549細胞的生長抑制率100 mg·L－1rs TRAIL作用A549細胞12 h后,細胞生長抑制率為(5.61±0.32)%;20μmol·L－1LY294002分別作用2、4、8和16 h后,再應用100 mg·L－1rs TRAIL蛋白作用12 h,A549細胞的生長抑制率分別為(74.6±2.63)%、(75.9±2.97)%、(76.7±2.84)%和(78.4±3.12)%;與rs TRAIL蛋白組比較,LY294002＋rs TRAIL蛋白組A549細胞的生長抑制率明顯升高(P＜0.05)。

2.2 2組A549細胞的周期與rs TRAIL蛋白組比較,LY294002＋rs TRAIL蛋白組G1期A549細胞百分率明顯升高(P＜0.05),S期細胞百分率明顯降低(P＜0.05)。見表1。

2.3 2組A549細胞凋亡率LY294002＋rs TRAIL蛋白組A549細胞凋亡率為(61.5± 3.02)%,明顯高于rs TRAIL蛋白組(3.21%± 0.96%)(P＜0.05)。

表1 流式細胞術檢測2組A549細胞周期Tab.1 Cell cycle of A549 cells detected by flow cytometry in two groups(±s,η/%)

表1 流式細胞術檢測2組A549細胞周期Tab.1 Cell cycle of A549 cells detected by flow cytometry in two groups(±s,η/%)

?P＜0.05 compared with control group.

Group Percentage of A549 cells G1G2S rs TRAIL 54.12±2.46 13.54±2.23 32.34±1.75 LY294002＋rsTRAIL 81.74±3.12?7.07±1.59 11.19±1.26?

2.4 2組A549細胞中p-Akt、c-FLIPL、Bcl-2和Bax蛋白表達水平與rs TRAIL蛋白組比較, LY294002＋rs TRAIL蛋白組A549細胞中p-Akt、c-FLIPL和Bcl-2蛋白表達水平下調,Bax表達水平無明顯改變。見圖1。灰度分析結果:與rs TRAIL蛋白組比較,LY294002＋rs TRAIL蛋白組p-Akt、c-FLIPL和Bcl-2蛋白表達水平下降(P＜0.05),Bax/Bcl-2比值升高2.21倍(P＜0.05)。見表2。

圖1 2組A549細胞中p-Akt、c-FLIPL、Bcl-2和Bax蛋白表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of p-Akt,c-FLIPL, Bcl-2 and Bax proteins in A549 cells in two groupsLane 1:LY294002＋rs TRAIL group;Lane 2:rs TRAIL group.

3 討論

目前化療依然是NSCLC治療的主要手段,但應用化療治療NSCLC(尤其是晚期患者)已經達到了平臺期,為了進一步提高NSCLC的治療效果,需要探索新的安全有效的臨床用藥。TRAIL能選擇性地殺死腫瘤細胞,抑制動物體內移植瘤的形成與生長,而對大多數正常組織和細胞無明顯毒性,耐藥細胞株的出現限制了TRAIL抗腫瘤的應用范圍[1,4-5]。

表2 各組A549細胞中p-Akt、c-FLIPL、Bcl-2和Bax蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of p-Akt,c-FLIPL,Bcl-2,and Bax proteins in A549 cells in two groups(±s)

表2 各組A549細胞中p-Akt、c-FLIPL、Bcl-2和Bax蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of p-Akt,c-FLIPL,Bcl-2,and Bax proteins in A549 cells in two groups(±s)

?P＜0.05 compared with rs TRAIL group.

Goup p-Akt/β-actin c-FLIPL/β-actin Bcl-2/β-actin Bax/β-actin Bax/Bcl-2 rs TRAIL 1.10±0.25 0.79±0.19 0.62±0.14 0.45±0.12 0.73±0.24 LY294002＋rs TRAIL 0.17±0.09?0.21±0.07?0.33±0.10?0.53±0.16 1.61±0.38?

PI3K/Akt通路活化在人類惡性腫瘤中非常普遍,活化的PI3K/Akt通路可以激活下游多條信號通路的轉導,促進NSCLC的發展和參與腫瘤的耐藥[8]。LY294002為人工合成的小分子化合物,是PI3K/Akt信號通路的特異性抑制劑,通過共價結合到PI3K的賴氨酸殘基,靶向抑制PI3K催化亞基p110的活化[9]。本課題組前期研究[4-5]結果表明:A549細胞內高表達c-FLIPL蛋白導致的Caspase-8活化抑制是細胞抵抗rs TRAIL蛋白誘導凋亡的重要原因,Willems等[10]研究發現:p-Akt是導致細胞內c-FLIPL蛋白水平升高的重要原因, Akt活化的特異性抑制劑能夠降低c-FLIPL蛋白水平。本研究結果顯示:PI3K靶向抑制劑LY290042能夠抑制PI3K的活性從而降低p-Akt蛋白的表達水平,伴隨著p-Akt蛋白表達水平的降低,c-FLIPL蛋白表達水平亦降低,rs TRAIL蛋白聯合LY290042共同作用于A549細胞后細胞凋亡率明顯升高,說明PI3K/Akt通路參與調節c-FLIPL蛋白對TRAIL誘導凋亡的抵抗作用。

PI3K/Akt通路是抑制細胞凋亡的中樞介質, p-Akt可以磷酸化凋亡蛋白的絲氨酸位點,改變其空間構象,阻止凋亡蛋白進入細胞核或者促進抗凋亡與之結合,從而抑制細胞凋亡。研究[11]證實: PI3K/Akt通路的激活可以導致Bcl-2蛋白表達水平升高,參與阻止TRAIL引起的線粒體細胞凋亡途徑的激活。本研究結果顯示:LY290042抑制p-Akt表達的同時,促進了Bcl-2蛋白表達降低,說明LY290042可能促進TRAIL激活的線粒體途徑細胞凋亡能力。有關前列腺癌、直腸癌、白血病和宮頸癌等的臨床研究[12-13]發現:Bcl-2家族成員的構成比例是凋亡調控的關鍵因素,尤其是Bax/Bcl-2比值是啟動細胞凋亡的“分子開關”,直接決定了線粒體外膜各種通道的開放程度。外界因素刺激可以通過調節Bcl-2和Bax 2種調控因子的平衡改變細胞的命運。盡管Bcl-2和Bax的表達均可被Akt調節[14],但本研究結果顯示:PI3K/ Akt抑制劑LY290042并未改變A549細胞中Bax的表達水平,但可以通過降低Bcl-2蛋白表達水平,增加Bax/Bcl-2比值,促進細胞凋亡信號的啟動。

綜上所述,20μmol·L－1LY290042作用2 h可以有效改善凋亡相關蛋白的表達水平,從2條凋亡途徑增強TRAIL引起的腫瘤細胞凋亡作用;同時LY290042還可以增加G1期A549細胞的百分比,降低腫瘤細胞的增殖速度。G1期細胞的百分比增加可以增強TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡的敏感性[15]。PI3K/Akt可以作為良好的靶點應用于NSCLC的治療研究。

[1]Subramanian J,Waqar SN,Morgensztern D,et al.Recent advances in lung cancer:summary of presentations from the 47th annual meeting of the American Society of Clinical Oncology(ASCO)2011[J].J Thorac Oncol,2012,7(1): 260-265.

[2]Stuckey DW,Shah K.TRAIL on trial:preclinical advances in cancer therapy[J].Trends Mol Med,2013,19(11): 685-694.

[3]Spierings DC,de Vries EG,Timens W,et al.Expression of TRAIL and TRAIL death receptors in stageⅢnon-small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res,2003,9(9):3397-3405.

[4]劉 磊,方艷秋,譚 巖,等.重組可溶性TRAIL表達及誘導A549和H460wt細胞凋亡[J].吉林大學學報:醫學版, 2008,34(2):270-273.

[5]譚 巖,劉 磊,方艷秋,等.抑制c-FLIPL表達增強rs TRAIL蛋白殺傷肺癌A549細胞的研究[J].中國免疫學雜志,2012,10(10):890-893.

[6]Ning J,Liu W,Zhang J,et al.Ran GTPase induces EMT and enhances invasion in non-small cell lung cancer cells through activation of PI3K-AKT pathway[J].Oncol Res, 2014,21(2):67-72.

[7]Zhao P,Meng Q,Liu LZ,et al.Regulation of survivin by PI3K/Akt/p70S6K1 pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,395(2):219-224.

[8]Yun F,Jia Y,Li X,et al.Clinicopathological significance of PTEN and PI3K/AKT signal transduction pathway in nonsmall cell lung cancer[J].Int J Clin Exp Pathol,2013,6(10):2112-2120.

[9]Yang CM,Lin MI,Hsieh HL,et al.Bradykinin-induced p42/p44 MAPK phosphorylation and cell proliferation via Src, EGF receptors,and PI3-K/Akt in vascular smooth muscle cells[J].J Cell Physiol,2005,203(3):538-546.

[10]Willems L,Tamburini J,Chapuis N,et al.PI3K and m TOR signaling pathways in cancer:new data on targeted therapies[J].Curr Oncol Rep,2012,14(2):129-138.

[11]Han Z,Hong L,Han Y,et al.Phospho Akt mediates multidrug resistance of gastric cancer cells through regulation of P-gp,Bcl-2 and Bax[J].J Exp Clin Cancer Res,2007, 26(2):261-268.

[12]Mohan S,Abdelwahab SI,Kamalidehghan B,et al.Involvement of NF-κB and Bcl2/Bax signaling pathways in the apoptosis of MCF7 cells induced by a xanthone compound Pyranocycloartobilox-anthone A[J].Phytomedicin,2012, 19(11):1007-1015.

[13]Ren X1,Zhang Y,Li C,et al.Enhancement of baicalin by hexamethylene bisacetamide on the induction of apoptosis contributes to simultaneous activation of the intrinsic and extrinsic apoptotic pathways in human leukemia cells[J].Oncol Rep,2013,30(5):2071-2080.

[14]Dan HC,Baldwin AS.Differential involvement of IkappaB kinases alpha and beta in cytokine-and insulin-induced mammalian target of rapamycin activation determined by Akt[J].J Immunol,2008,180(11):7582-7589.

[15]Ehrhardt H,Wachter F,Grunert M,et al.Cell cyclearrested tumor cells exhibit increased sensitivity towards TRAIL-induced apoptosis[J].Cell Death Dis,2013,4: e661.

Enhanced effect of rsTRAIL-based therapy for A549 cells by phosphatidylinositol 3′-kinase inhibitor LY294002

LIU Lei1,FANG Yan-qiu1,QI Ya-ling2,LU Xiao-dan1,WEI Hai-feng1,TAN Yan1
(1.Tumor Biological Treatment Center,Jilin Province People’s Hospital,Changchun 130021,China; 2.Department of Histology and Embryology,School of Basic Medical Science,Jiamusi University, Jiamusi 154007,China)

ObjectiveTo explore the potential mechanisms of non-small cell lung carcinoma cells to rs TRAIL protein-induced apoptosis by phosphatidylinositol 3′-kinase(PI3K/Akt)inhibitor LY294002,and to provide new ways to increase killing activities of rs TRAIL protein for non-small cell lung cancer.MethodsThe A549 cells at logarithmic growth phase were selected and randomly divided into rs TRAIL group and LY294002＋rs TRAIL group.The inhibitory rate of growth of the A549 cells was tested by MTT assay.The cell cycle and apoptotic rate were detected by flow cytometry analysis.The expression levels of Ser473 phosphorylated form of Akt(p-Akt),c-FLIPLprotein and Bcl-2 protein in the A549 cells in two groups were analyzed by Western blotting method.ResultsThe inhibitory rate of growth of the A549 cells in LY294002＋rs TRAIL group(74.6%±2.63%)was higher than that in rs TRAIL group(5.61%±0.32%)(P＜0.05).Compared with rs TRAIL group,the percentage of the cells at G0/G1phase in LY294002＋rs TRAIL group was increased(P＜0.05)and the percentage of the cells at S phase was decreased(P＜0.05).The apoptotic rate of the A549 cells in LY294002＋rs TRAIL group(61.5%±3.02%)was higher than that in rs TRAIL group(3.21%±0.96%)(P＜0.05).The Western blotting results showed that the expression levels of p-Akt,c-FLIPL and Bcl-2 proteins in the A549 cells in LY294002＋rs TRAIL group were decreased(P＜0.05)and the ratio of Bax/Bcl-2 was increased(P＜0.05)compared with rs TRAIL group.ConclusionLY294002 can increase the killing activity of rs TRAIL protein in A549 cells by inhibiting the activity of PI3K.

cancer non-small cell lung;A549 cells;TNF-related apoptosis inducing ligand;LY294002;PI3K/Akt

R733.6

A

2014-01-21

吉林省科技廳基礎項目資助課題(201115201);吉林省科技廳重點實驗室項目資助課題(20122113);吉林省衛生廳科研基金資助課題(20082036);吉林省科技廳科技創新項目資助課題(20082102)

劉 磊(1978－),男,黑龍江省齊齊哈爾市人,醫師,醫學博士,主要從事腫瘤免疫相關研究。

方艷秋(Tel:0431-85595659,E-mail:yq.fang＠163.com);齊亞靈(Tel:0454-8618297,E-mail:qiyaling87016＠163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-0972-05

10.13481/j.1671-587x.20140513