香榧古樹的遺傳差異性

何 明，董雷鳴，劉浩凱，張 輝，曾燕如，錢秋鳳，喻衛武，戴文圣

（浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

香榧古樹的遺傳差異性

何 明，董雷鳴，劉浩凱，張 輝，曾燕如*，錢秋鳳，喻衛武，戴文圣

（浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

對香榧主產地浙江省諸暨、紹興、嵊州、東陽、磐安的5個香榧古樹群體共149個樣品進行了SRAP標記分析，共檢測到260個位點，其中多態位點170個，多態位點占為65.38%（PPL%）；群體觀察到的等位基因數（Na）為1.653 8，有效等位基因數（Ne）為1.2713，基因多樣性指數（H）為0.169 6，Shannon信息指數（I）為0.266 4；群體總的基因多樣性指數（Ht）平均為0.1694，分化系數（Gst）為0.144 2，群體內基因多樣度（Hs）為0.145 0，群體間基因流（Nm）為2.967 5；利用加權平均數法（UPGMA）對香榧古樹居群間進行了聚類分析，結果東陽、嵊州兩個居群先聚在一起，再與磐安居群聚在一起，而紹興和諸暨居群聚在一起，最后再與磐安、東陽、嵊州居群聚在一起。研究結果表明，香榧古樹接穗來源非唯一，是一個栽培類型，同時群體間有基因交流，既有分離又保持相對較高的相似性。

香榧；SRAP；遺傳差異

榧樹（Torreya grandis）隸屬紅豆杉科榧屬，為我國特有的古老物種之一，系第三紀孑遺植物[1]。香榧（T.grandis cv.Merrillii）是榧樹的優良變異類型經過人工選育后嫁接繁殖栽培的優良栽培類型[2]，也是目前榧樹中唯一進行人工規模化栽培的優良栽培類型，起源于浙江省的會稽山區，具有千年的栽培歷史，以其特有的形態特征、生物學特性、經濟性狀和產地分布而區別于其他榧樹自然類型，具有食用、藥用、材用、綠化等多種用途[3]。近年來香榧的經濟效益不斷增長，因而在其生態適應區得到了大力推廣與發展，在榧樹自然分布區安徽、江西等省大量引種栽培。其種仁炒熟后松脆可口，營養豐富，香味獨特，有化痰、止咳、潤肺、明目等功效。此外，香榧還可以提煉出具有抗癌活性的生理活性物質——紫杉醇[4]。

國外由于沒有香榧種植栽培歷史，對香榧的研究報道極少。20世紀90年代開始，黎章矩等對香榧栽培類型中的性狀分離和再選擇進行了較系統的研究，從香榧中選出了70多個高產優質的優株。從其研究結果看，香榧內分離已很明顯。韓寧林等也有類似的發現[5]。近年來，香榧栽培類型內退化和分離已普遍顯現，有的成年樹單株產量從幾千克到幾百千克不等，各地都有相當比例的成年樹產量很低，甚至十多年、幾十年不結實。分析其原因，可能：①香榧嫁接起源母株不具備唯一性；②多次嫁接繁殖及其他的人為生產干預引起了分離及退化。因此，有必要開展香榧古樹的分子評價，探討主產區香榧的來源與分離程度，為今后保持香榧優良遺傳本質措施的制訂提供理論依據。

香榧的主產地在浙江會稽山區的5個縣（市），即諸暨、紹興、嵊州、東陽、磐安，中心產區不乏千年古樹。這五個縣市現有結實香榧大樹約10萬株左右，其中諸暨市約4萬余株，嵊州市2.83萬株，紹興縣1.7萬株，東陽市1.0萬株，磐安縣3 900余株；100年生以上大樹占80%以上，其中300 ～ 1 300 a的古樹超萬株，它們多以單株或小片古樹群的形式存在[6]，是浙江省現存的古樹名木群體中數量最多的樹種。

本研究利用SRAP標記分析技術，以香榧主產地浙江會稽山區的5個縣（市）——諸暨、紹興、嵊州、東陽、磐安的香榧古樹（100年以上）樣本為實驗材料，評價古樹群體的遺傳差異性。相關的內容尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料采自香榧主產地浙江會稽山區諸暨、紹興、嵊州、東陽、磐安5個縣（市）的香榧古樹林。采樣時由當地老農做向導，確保采樣株的年齡在100 a以上。由于香榧是榧樹的優良變異類型經過人工選育后嫁接繁殖栽培的優良栽培類型，因此每個群體單株間至少相距100 m。采摘的葉片存放在帶硅膠的塑料袋中，帶回實驗室后－40℃下保存備用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測 DNA提取與檢測采用劉浩凱等優化的改良CTAB法[7]。

1.2.2 SRAP標記分析與產物檢測 劉浩凱等參照沈登峰的方法[8]，對包括PCR反應體系、引物篩選及電泳在內的SRAP分析體系進行了優化。本文采用的是優化后的方法體系[7]。

1.2.3 數據分析 電泳圖譜每一條帶（DNA片段）為一對引物的結合位點。對于多態位點，有擴增產物的記作1，反之記為0，獲得二元數據矩陣，并計算多態位點百分率（PPL，%）。用Popgene 1.32分析觀察到的等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Nei’s基因多樣性（H）、香農信息指數（I）、基因多樣性指數（Ht）、居群內基因多樣性（Hs）、居群間基因分化系數（Gst），并基于Gst計算居群間的基因流Nm =繪制基于親緣關系的居群聚類圖，評價群體內及群體間的遺傳差異性。

2 結果與分析

2.1 樣品采集

從浙江省磐安（PA）、東陽（DY）、嵊州（SZ）、紹興（SX）、諸暨（ZJ）分別采集了32、25、30、30、32個單株，共149個樣品。

2.2 DNA 的提取

采用改良CTAB法提取的香榧基因組DNA濃度較高，平均大于1 000 ng/μL，有的甚至高達3 000 ng/μL，且純度較高，OD260/OD280值1.8 ～ 2.0（表1）。電泳檢測表明，提取的DNA條帶清晰，質量高（圖1），可以用于后續的實驗。

表1 部分樣品的DNA濃度及OD值Table 1 Concentration of gDNAs extracted from some of samples and their OD values

圖1 香榧基因組DNA的瓊脂糖電泳檢測Figure 1 Electrophoresis profile of gDNAs extracted from T.grandis cv.Merrillii

2.3 SRAP 標記分析

用篩選出的10對SRAP引物組合（表2）對149份香榧樣品進行DNA擴增，共檢測到260個清晰且可重復的有效位點，其中多態性位點170個，多態位點百分率為65.38%（圖2，表2）。各對引物擴增的位點數為4～31個，擴增片段大小為100 ～ 1 000 bp，每對引物擴增出的多態位點百分率因引物而異，為22.22% ～ 96.88%。

圖2 部分樣品的SRAP擴增譜帶（引物對F1R1）Figure 2 SRAP amplification band of the DNAs of some samples (primer pair: F1R1)

表2 SRAP引物組合及擴增結果Table 2 SRAP primer pairs and their amplification results

2.4 香榧古樹群體的遺傳差異性分析

在居群水平上，所有引物擴增產物的多態性在不同居群中的分布數量不同，不同居群的多態位點百分率為43.85% ～ 56.54%，由高到低依次是東陽、嵊州、諸暨、磐安、紹興居群；基于Shannon信息指數、Nei's基因多樣性指數、觀測的等位基因數及有效等位基因數的居群排列順序也相同，結果5個居群中東陽居群的遺傳差異性最大，紹興居群則最小。

5個香榧居群的Ht平均為0.169 4，Hs平均 0.145，Gst平均為 0.144 2，Nm平均為2.967 5，表明香榧居群內遺傳差異性高于居群間，不同居群間遺傳分化相對較低。

表3 香榧5個居群的遺傳參數值Table 3 Genetic parameters in T.grandis cv.Merrillii from 5 counties

2.5 香榧古樹居群間的關系

5個古樹居群（PA、DY、SZ、SX、ZJ）的遺傳相似度在0.954 3 ～ 0.981 2，平均為0.964 5，平均遺傳距離為0.036 2，說明相似度較高；DY和SX之間的遺傳距離最小，為0.018 9；SZ與SX間的遺傳距離最大，為0.046 8（表4）。

表4 香榧古樹5個群體的遺傳相似性（對角線上）和遺傳距離（對角線下）Table 4 Nei’s genetic identity and genetic distance of T.grandis cv.Merrillii among 5 counties

基于 Nei's遺傳距離對各居群進行UPGMA聚類可知（圖 3），東陽居群和嵊州居群聚在一起，再與磐安居群聚在一起；紹興居群和諸暨居群聚在一起，最后再與東陽、嵊州、磐安居群聚在一起。

圖3 香榧古樹5個居群基于Nei’s遺傳相似性的UPGMA聚類圖Figure 3 UPGMA dendrograme based on Nei’s genetic identity of T.grandis cv.Merrillii From 5 counties

3 討論

利用SRAP分子標記技術對 5個香榧古樹群體的遺傳多樣性和遺傳分化進行了分析，結果表明，香榧物種水平的多態位點百分率PPL達65.38%，群體水平的PPL變幅較大，在22.22% ～ 96.88%，且東陽 ＞ 嵊州 ＞ 諸暨 ＞ 磐安 ＞ 紹興。與其他裸子植物基于ISSR或RAPD的PPL進行比較，香榧比銀杏（PPB = 52.27%）、水杉（PPB = 38.62%）和銀杉（PPB = 32%）天然群體[9～11]要高得多。這說明香榧其接穗來源非唯一，是一個栽培類型；同時，經過上千年的無性繁育，加上榧樹這個物種本身雌雄異株，香榧的授粉樹為榧樹的特性，在香榧這個栽培類型內產生了遺傳分化。因此，香榧本身具有進行再選擇的潛力及必要，同時也具有開展優良雄性種質資源選育的必要。

5個香榧古樹群體的Ht為 0.169 4，說明個體間存在基因變異。其中有 14.42%的遺傳差異存在于群體間，85.58%的遺傳差異存在于群體之內，Gst為0.144 2，低于遠交物種和多年生物種的平均值（Gst = 0.22和Gst = 0.19）[12]，表明香榧遺傳差異主要集中在群體內。與雌性榧樹相比[7]，香榧Gst要高于榧樹，其余參數Ne、H、I、Ht、Hs、PPL、Nm等均低于榧樹；群體間遺傳相似度在0.95以上，說明香榧群體間既有基因交流，又保持相對較高的一致性。相對而言，5個居群中東陽居群的遺傳差異性最大，紹興居群的遺傳差異性最小，這一現象是否與香榧的起源有關還有待于進一步探討。

基因流是影響群體內部和群體間遺傳差異程度的重要因素[13]。遺傳結構是通過物種群體內和群體間遺傳分化來體現的，基因流的大小也可以反映群體遺傳結構的大小。一般來說，基因流大的物種，種群間遺傳分化小，大的基因流可以阻止群體間的遺傳分化[14]。Hamrick等[15]認為，基因流Nm大于1，就足以抵制遺傳漂變的作用，也同時防止了群體分化的發生。本研究中香榧古樹群體物種水平上的基因流（Nm）為2.967 5，表明群體之間存在著比較頻繁的基因交流，有效地阻止了遺傳漂變的發生，群體之間的遺傳差異不明顯。香榧為雌雄異株風媒植物，且栽培較為集中，各群體間的地理位置較近，有利于群體間的基因交流。現實生產中，香榧與榧樹間自由雜交，只要是采自香榧的種子多是可食的，而大多數榧樹的種子食用質量差，多用于實生繁殖，用作嫁接香榧的砧木。這也說明香榧是一個栽培類型。研究發現，從香榧與榧樹種子的品嘗評價看，種粒小，種形細長，淀粉質量分數低，油脂質量分數高的榧樹種子風味品質好，反之一般不能直接食用[6]。盡管香榧種子自由授粉產生，結果在香榧栽培類型內產生變異，但似乎香榧本身有一種選擇雄性花粉的機制，使得香榧種子具有含油率高、可食的特質。

香榧的存在已有千年的歷史，其古樹群體應該得到保護。但其在長期栽培過程中的退化、分離在所難免。為了保持香榧的品質，有必要對其進行再選擇復壯。

[1] 張紹堯，丁炳楊.《浙江植物志》（總論卷）[M].浙江科技出版社，1993.

[2] 黎章矩，程曉建，戴文圣，等.香榧品種起源考證[J].浙江林學院學報，2005，22（4）：443－448.

[3] 陳力耕，王輝，童品璋.香榧的主要品種及其開發價值[J].中國南方果樹，2005，34（5）：33－34.

[4] WANG Jianfeng, HUANG Yaojian, FANG Meijuan, et al.Brefeldin A, a cytotoxin produced by Paecilomyces sp.and Aspergillus clavatus isolated from Taxus mairei and Torreya grandis [J].FEMS Immunol Med Microbiol，2002，34（1）：51－57.

[5] 韓寧林，胡文翠，王東輝，等.香榧優良品種細榧內的4個優良類型調查研究[J].林業科學研究，2007，（5）：604－608.

[6] 程曉健，黎章矩，戴文圣，等.榧樹種質資源調查與評價[J].果樹學報，2009，26（5）：654－658.

[7] 劉浩凱，胡樹恒，董雷鳴，等.雌性榧樹4個居群遺傳多樣的SRAP分析[J].經濟林研究，2014（3）：30－35.

[8] 沈登鋒.榧樹種質資源的收集、評價與核心種質的確定[D].臨安：浙江農林大學，2011.

[9] 葛永奇，邱英雄，丁炳揚，等.孑遺植物銀杏群體遺傳多樣性的ISSR分析[J].生物多樣性，2003，11（4）：276－287.

[10] 李曉東，黃宏文，李建強.孑遺植物水杉的遺傳多樣性研究[J].生物多樣性，2003，11（2）：100－108.

[11] 汪小全，劉正宇.銀杉遺傳多樣性的RAPD分析[J].中國科學（C輯），1996，26（5）：436－441.

[12] Nybom Hilde.Comparison of different nuclear DNA markers for estimating intraspecific genetic diversity in plants [J].Mol Ecol，2004，13（5）：1 143－1 155.

[13] Slatkin M.Gene flow and the geographic structure of natural populations[J].Science，1987，3576198（787）：236.

[14] Ellstrand Norman C，Elam Diane R.Population genetic consequences of small population size：implications for plant conservation [J].Annu Rev Ecol Syst，1993：217－242.

[15] Hamrick JL，Godt MJW，Sherman-Broyles SL.Gene flow among plant populations: evidence from genetic markers.In Experimental and Molecular Approaches to Plant Biosystematics [M].1995：215－232.

Genetic Differences in Ancient Torreya grandis cv.Merrillii Trees

HE Ming，DONG Lei-ming，LIU Hao-kai，ZHANG Hui，ZENG Yan-ru*，QIAN Qiu-feng，YV Wei-wu，DAI Wen-sheng
（Nurturing Station for State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China）

Leaves from 149 ancient Torreya grandis cv.Merrillii trees were collected in 5 counties (cities) such as Dongyang (DY), Pan’an (PA), Shengzhou (SZ), Zhuji (ZJ) and Shaoxing (SX), Zhejiang province.SRAP (sequence related amplified polymorphism) analysis on 149 samples resulted that a total of 260 loci was detected, among them 170 of polymorphic (Np), accounting for 65.38% of the total one.Number of alleles (Na) was 1.653 8, number of effective alleles (Ne) 1.271 3, Nei’s gene diversity index (H) 0.1696, Shannon Information index (I) 0.266 4, total gene diversity (Ht) 0.1694, genetic differentiation (Gst) 0.144 2, gene diversity within population (Hs) 0.145 0 and gene flow (Nm) 2.967 5.Cluster analysis indicated that the scions of the old trees may not be from the same source and there were gene exchanges among populations, which led to separation but relatively high identity.

Torreya grandis cv.Merrillii; SRAP; genetic difference

S718.46

A

1001-3776（2014）06-0001-05

2014-06-09；

2014-10-10

浙江省教育廳科研項目（Y201121027）；省科技廳浙江省果品農業新品種選育重大科技專項（2012C12904-12）

何明（1979－），女，山東肥城人，助理研究員，碩士，從事森林培育研究；*通訊作者。