紅球菌CCZU10-1選擇性氧化拆分外消旋苯甲亞砜的性能

楊振興，陶志成，何玉財，王利群，張躍，邢震，龔磊，潘雪鶴

（常州大學制藥與生命科學學院生物工程研究室，江蘇 常州 213164）

紅球菌CCZU10-1選擇性氧化拆分外消旋苯甲亞砜的性能

楊振興，陶志成，何玉財，王利群，張躍，邢震，龔磊，潘雪鶴

（常州大學制藥與生命科學學院生物工程研究室，江蘇 常州 213164）

為了高效地合成高光學純手性亞砜，在單水相體系中利用Rhodococcussp. CCZU10-1選擇性氧化拆分外消旋苯甲亞砜（rac-PMSO）合成了(S)-PMSO（ee＞99.9%）。通過考察反應pH值、反應溫度、搖床轉速、輔助底物、生物催化劑添加量對催化反應的影響，確定了最適反應條件。結果表明最適反應條件為：反應pH值8.0、反應溫度30℃、搖床轉速180r/min、輔助底物為半乳糖（50mmol/L）、細胞濃度為0.08g(濕重)/mL。在最適反應條件下生物轉化20mmol/L rac-PMSO時，(R)-PMSO完全轉化，(S)-PMSO（ee＞99.9%）產率為47.1%。因此，研究結果為工業化生產(S)-PMSO奠定了基礎。

紅球菌屬；(S)-苯甲亞砜；拆分；生物轉化；優化

光學純手性亞砜是一種重要的藥物中間體和手性助劑[1]，可通過不對稱氧化前手性硫化物或者不對稱氧化拆分外消旋亞砜獲得[2]。不對稱氧化硫化物可通過金屬催化劑或純化酶催化進行[3]，也可用整細胞催化進行[4]。相比之下，用整細胞系統催化不對稱氧化硫化物具有更多的優點，可避免手性金屬配合物和純化酶的使用，因此更有發展前途和應用前景。雖然利用整細胞氧化拆分外消旋亞砜合成光學純亞砜的最大理論產率僅為50%，但是其砜類產物也是非常有用的藥物（例如多菲萊德、舒多昔康、煙嘧磺隆等）中間體[5-6]。到目前為止，少有報道利用整細胞氧化拆分外消旋亞砜高效制備高光學純亞砜的研究。利用黑曲霉[7]不對稱氧化拆分外消旋亞砜時，ee較低（＜50%）；利用Rhodococcussp.ECU0066[8]不對稱氧化拆分外消旋亞砜時，(S)-PMSO產率較低 (＜45%)。因此，利用整細胞氧化拆分外消旋亞砜制備光學純亞砜仍有上升發展空間。

最近，作者利用Rhodococcussp. CCZU10-1進行氧化拆分rac-PMSO，通過對反應pH值、反應溫度、搖床轉速、輔助底物等參數進行了優化，實現了高光學純(S)-PMSO (ee＞99%，產率47.1%)的高效合成。

1 實驗材料與方法

1.1 試劑和藥品

外消旋苯甲亞砜和苯甲砜購自上海隆盛化工有限公司，分析純；蛋白胨和酵母膏購自國藥集團化學試劑有限公司，生化級；其他試劑均為國產分析級。

1.2 主要儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀；R2ID旋轉蒸發儀，鞏義市予化儀器制造有限公司；THZ-072 HT恒溫搖床，上海博彩生物科技有限公司。立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50KBS上海申安醫療器械廠；離心機TGL-16G上海安亭科學儀器廠。

1.3 菌株

Rhodococcussp. CCZU10-1[9]，作者實驗室篩選獲得。

1.4 培養

首先在250mL搖瓶裝液50mL培養基培養紅球菌24h。培養溫度為30℃，培養的轉速為180r/min，培養基的成分為：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 1.5g/L，KH2PO42g/L，無水MgSO40.3g/L，pH值7.0。培養24h，加入誘導劑rac-PMSO（終濃度為0.1mmol/L），繼續培養24h后離心（10000g，5min）收獲細胞，然后重懸浮于K2HPO4-KH2PO4（100mmol/L，pH值8.0）緩沖溶液待用。

1.5 rac-苯甲亞砜的氧化反應

在單水相體系，氧化拆分外消旋苯甲亞砜是在10mL帶塞的搖瓶中進行的。收獲的靜息細胞Rhodococcussp. CCZU10-1（0.16g濕菌）重懸于2mL K2HPO4-KH2PO4緩沖溶液（100mmol/L，pH值8.0）。20mmol/L外消旋苯甲亞砜在紅球菌作用下，進行選擇性氧化拆分反應（30℃和180r/min）。反應結束后，利用等體積乙酸乙酯萃取反應體系3次，萃取液進一步利用無水硫酸鈉干燥過夜，減壓濃縮至干，2mL乙醇重新溶解后，分析(S)-PMSO的產率和(S)-PMSO的對映體過量值(ee)。

1.6 分析方法

液相色譜（HPLC）檢測法：(S)-PMSO的產率和ee值的測定是通過Daicel的OD-H柱測定。

檢測條件：Chiracel OD-H柱（4.6mm×250mm，5 μm），正己烷∶異丙醇=93∶7（體積比），流速為1mL/min，檢測波長254nm。(R)-PMSO、苯甲砜和(S)-PMSO的出峰時間分別為20min、24min和26min。

產物的產率(Yield)和對映體過量值(ee)計算方法如式（1）和式（2）。

式中，SR0和SS0分別表示反應前(R)-PMSO和(S)-PMSO的初始濃度；SR和SS分別表示(R)-PMSO和(S)-PMSO的濃度。

2 實驗結果與分析

2.1 反應pH值對氧化PMSO的影響

反應pH值對生物催化反應有著明顯的影響，不同反應pH值使底物和生物催化劑的反應所處環境和狀態不同，導致pH值影響生物催化劑的活性[10-11]。如圖1所示，反應pH值(5.0～10.0)對Rhodococcussp. CCZU10-1氧化PMSO活性有著明顯的影響。在pH值8.0時，催化活性達到最大值。因此，最適反應pH值為8.0。

2.2 反應溫度對氧化PMSO的影響

反應溫度也對催化活性[12-13]有明顯的影響。如圖2所示，不同反應溫度（25～45℃）對Rhodococcussp. CCZU10-1氧化PMSO的影響比較顯著。當溫度為30℃時，催化活性達到最大值。繼續提高反應溫度，催化活性明顯下降。因此，30℃為Rhodococcussp. CCZU10-1最適反應溫度。

圖1 反應pH值對氧化PMSO活性的影響

圖2 反應溫度對氧化PMSO活性的影響

2.3 搖床轉速對氧化PMSO的影響

搖床轉速對體系溶氧有著顯著地影響[14]，從而影響Rhodococcussp. CCZU10-1對rac-PMSO氧化活性。如圖3所示，在低轉速（120r/min）下，溶氧較低，導致氧化活性較低；轉速提高到180r/min，氧化活性明顯地提高；繼續提高轉速，氧化活性提高不明顯。因此，180r/min為最適搖床轉速。

2.4 輔助底物對氧化PMSO的影響

在生物催化氧化還原反應過程中添加輔助底物可以促進輔酶再生，從而提高催化效率[15]。10種潛在的輔助底物（半乳糖、甘露糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、乙醇、丙三醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇）（50mmol/L）對Rhodococcussp. CCZU10-1氧化PMSO的影響進行了考察。如圖4所示，不同的輔助底物對Rhodococcussp. CCZU10-1氧化PMSO有著顯著地影響。當輔助底物為半乳糖時，催化活性達到最大。因此，最適輔助底物為半乳糖（50mmol/L）。

2.5 生物催化劑添加量的影響

圖3 搖床轉速對氧化PMSO活性的影響

圖4 輔助底物對氧化PMSO活性的影響

反應過程中，生物催化劑添加量是影響生物催化活性的重要因素之一[16]。因此，進一步考察不同Rhodococcussp. CCZU10-1靜息細胞添加量（0.01～0.2g/mL，濕重）對催化反應的影響。如圖5所示，細胞濃度對催化活性具有顯著的影響。當細胞濃度為0.08g (濕重)/mL時，催化活性達到最大。當細胞濃度大于0.08g/mL時，反應體系的黏度明顯增加，導致溶氧的降低，最終催化活性顯著下降。因此，0.08g (濕重)/mL為最適Rhodococcussp. CCZU10-1細胞添加量。

2.6 20mmol/L底物反應進程

在最適的反應條件下，對催化rac-PMSO（20mmol/L）進程進行了考察。如圖6所示，隨著反應時間的延長，(R)-PMSO濃度顯著地下降，苯甲砜濃度顯著地上升，而(S)-PMSO大部分保留在反應體系中。反應6h，(R)-PMSO完全轉化，而(S)-PMSO（ee＞ 99.9%，圖7）的產率為47.1%?？赡艿拇呋磻猺ac-PMSO途徑如圖8所示：Rhodococcussp. CCZU10-1對 (R)-PMSO有較高的催化活性，首先將其完全氧化為苯甲砜；而對(S)-PMSO催化活性較低，將其氧化為少量的苯甲砜；催化過程中苯甲砜未發現進一步反應。值得注意的是，(S)-PMSO和苯甲砜分別是治療胃潰瘍藥物（如奧美拉唑）和抗生素（如甲砜霉素）的關鍵中間體。

圖5 生物催化劑添加量對氧化PMSO活性的影響

圖6 催化rac-PMSO的反應進程

圖7 催化rac-PMSO反應前后手性HPLC譜圖

圖8 生物催化氧化rac-PMSO途徑

3 結 論

通過反應pH值、反應溫度、搖床轉速、輔助底物、細胞濃度等因素考察Rhodococcussp. CCZU10-1氧化拆分催化rac-PMSO活性的影響，確定了最適反應條件：反應pH值8.0，反應溫度為30℃，搖床轉速180r/min，輔助底物為半乳糖（50mmol/L），細胞添加量為0.08g (濕重)/mL。在20mmol/L體系中反應6h，(S)-PMSO （ee＞ 99.9%）的產率為47.1%。

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Selective oxidation resolution of racemic phenyl methyl sulfoxide with Rhodococcus sp. CCZU10-1

YANG Zhenxing，TAO Zhicheng，HE Yucai，WANG Liqun，ZHANG Yue，XING Zhen，GONG Lei，
PAN Xuehe
（Laboratory of Biochemical Engineering，School of Pharmaceutical Engineering and Life Sciences，Changzhou University，Changzhou 213164，Jiangsu，China）

To efficiently synthesize optically active chiral sulfoxides，Rhodococcussp.CCZU10-1 was used for the asymmetric resolution of rac-PMSO into (S)-PMSO (ee＞ 99.9%) in aqueous single-phase system. After optimization，the optimum reaction pH，reaction temperature，shaker speed，co-substrate，cells dosage were 8.0，30℃，180 r/min，galactose (50mmol/L) and 0.08g (wet weight)/mL，respectively. By biotransformation of rac-PMSO (20mmol/L) for 6h under the optimized conditions，(R)-PMSO was completely oxidized into the corresponding sulfone，and (S)-PMSO (ee＞ 99.9%) was obtained at a high yield of 47.1%. These results would lay the foundation of industrial production of (S)-PMSO.

Rhodococcussp.；(S)-PMSO；resolution；biotransformation；optimization

Q 814

A

1000-6613（2014）10-2744-05

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.10.037

2014-02-19；修改稿日期：2014-03-04。

國家自然科學基金（21102011）及江蘇省自然科學基金（BK20141172）項目。

楊振興（1988—），碩士研究生。聯系人：何玉財，博士，副教授。E-mail heyucai2001@163.com；yucaihe2007@aliyun.com。