Dicer在RNA沉默中的作用

何明洋

摘 要：RNA沉默是一種在真核生物中廣泛存在的防御機制，它的一個主要作用是抗病毒。為了闡明這個機制，很多植物病毒的功能蛋白都被用來做RNA沉默抑制子的研究。RNA III聚合酶家族的Dicer在基因沉默機制中發揮關鍵的作用，不同的物種含有不同數量和種類的Dicer，可以將外源的mRNA切割成21-26nt的小片段，從而阻斷外源基因的翻譯途徑，達到基因沉默的目的。病原物在進化的過程中，編碼沉默抑制子蛋白，對抗寄主的基因沉默。沉默抑制子通過與寄主的蛋白或外源RNA等互作，抑制寄主的基因沉默。關于Dicer與沉默抑制子的研究將給更好地解析基因沉默機制提供理論基礎。

關鍵詞：RNA沉默；沉默抑制子；Dicer

植物和無脊椎動物能夠利用基因沉默機制可以保護他們免受病毒的攻擊，RNA沉默在植物中被稱為轉錄后基因沉默，在真菌體內被稱為基因壓制，在動物體內被稱為RNA干涉[1]。

Dicer，是RNaseIII核酸內切酶超家族成員，其在RNA沉默過程中起著重要的作用，它在RNAi和miRNA形成的路徑中是一種關鍵的酶，RNAi和miRNA的產生過程中是需要dicer or dicer-like，同時它也在RNA沉默的效應階段起著重要的作用，能夠和RNA誘導的沉默復合體結合[2]。在RNA沉默的機制中，Dicer能夠長的雙鏈RNA剪切為短小的、寡核苷酸數量在21-24個堿基siRNA。緊接著這些siRNA被整合到RNA誘導的沉默復合體中，使復合體活化，然后與靶標mRNA結合并降解它。基因組序列測定表明真核基因組中的dcl蛋白數量從人類的一種dicer到模式生物擬南芥中的四種dicer不等。哺乳動物僅僅只有一個dcl蛋白，但它確參與了兩個不同途徑的RNA沉默過成：siRNA和miRNA；相反，在其他生物種發現了較復雜的dcl蛋白比如果蠅、擬南芥和真菌。這些dcl蛋白被指出是在RNA沉默過程中起著比較重要的作用。鑒于這些復雜的蛋白的功能特殊性，現在很多的學者很有興趣知道這些功能多樣性的dcl蛋白在進化過程中是怎樣和不同的RNA沉默的路徑相關的。

植物比其他真核生物含有更多的DICER-LIKE （DCL） enzymes和雙鏈RNA結合蛋白，能夠增加小RNA的復雜性。在擬南芥中，已經報道有四種基因編碼的蛋白屬于DCL家族成員（DCL1到DCL4），從NCBI數據庫中已報道的結論可知dcl3蛋白沒有任何的雙鏈RNA結合基序區域但是它卻含有兩個和雙鏈RNA結合基序區域的序列，而dcl1已經被報道與miRNA的產生有關，最近又有分析說dcl2和dcl3和病毒的siRNA和寄主內源siRNA的合成有關。通過分析單dcl突變體，雙dcl突變體，三dcl突變體和四dcl突變體的分析，只有dcl1作為一種復雜精細的酶能夠產生miRNA和siRNA，而其他的三種dcls僅僅只能產生siRNA。dcl2蛋白在一定的條件下能夠拮抗由dcl1蛋白產生的miRNA和siRNA的產生，在dcl1 dcl4和dcl1 dcl3 dcl4突變體中能夠使植物發病，然而突變體dcl1 dcl2 dcl3 dcl4植物中，不會是植物發病。同時研究還發現病毒的siRNA是由dcl4蛋白產生的，但當dcl4得活性降低時或者其活性被病毒抑制時，dcl2在一定條件下可以取代dcl4的功能。由于植物中小RNA組分的復雜性，每個dcl蛋白的具體功能（尤其是dcl2）還不是很清楚[3]。另外，能夠和特異的雙鏈RNA結合的蛋白是和細胞的信號傳導和基因表達相關的，同時還具有保守的雙鏈RNA結合基序。

而在哺乳細胞中，例如脆性X綜合癥蛋白（FMRP）已經被報道是miRNA的一部分，通過利用重組蛋白的方法，我們已經證明人類的脆性X綜合癥蛋白可以當做miRNA的受體蛋白對于核糖核酸酶Dicer來說，同時能夠和靶標RNA結合，使其降解。體內有效的RNA干涉所需要的miRNA已經被揭示了利用不同的siRNA誘導物誘導的報告基因沉默的方法[4]。在真菌體內，由于突變兩種dcls基因而使dcl蛋白的活性降低的實驗能夠消除轉基因誘導的基因沉默和使雙鏈RNA變成siRNA的形成過程。第一個說明在轉基因誘導的基因沉默中起作用的dicer蛋白是在RNA依賴性的RNA聚合酶作用下形成的雙鏈RNA參與的沉默過程中是起著重要作用的。絲狀真菌基因組中有兩種DCL基因（dcl1和dcl2）應經被證實。已有報道說如果存在dcl2突變體的情況下會破壞基因沉默從而使綠色熒光蛋白的強度增強，也能夠使siRNA的積累水平降低到無法檢測的水平[5]。但是，如果突變其他的DCL基因例如dcl1基因，它仍然會像野生型的一樣產生基因沉默也可以使siRNA積累到可以檢測的水平。報道還說明當在基因沉默不充分的表型真菌和由于dcl2基因突變無法積累siRNA的真菌體內都可以通過野生型（即帶有dcl2基因）真菌來使其恢復正常表型。這說明只有dcl2蛋白能夠促進siRNA的形成。

而在卷枝毛霉菌中，RNA沉默能夠出現不尋常的特點，比如正義鏈的自我復制，兩種反義鏈siRNA的積累。研究學者為了調查這種基因沉默是不是遵循他物種基因沉默機制，他們使用發夾RNA作為基因沉默的觸發器來分析在不同的基因環境下基因沉默的有效性和穩定性。結果表明，雙鏈RNA誘導的基因沉默機制也和兩種反義的siRNA的積累有關的。但是這種基因沉默的機制并不和前人研究的由dcl1基因有關，而是和另外一種基因dcl2有關，dcl2基因首先被識別和克隆，同時相應的無效突變體也由基因復制所產生。但是這種突變體在基因沉默中會被正義鏈自我復制或者反向重復基因所損傷，另外dcl2功能的行使也是需要兩種反義siRNA 的正常積累的。除了其在基因沉默中的重要作用，dcl2也在植物發展方面起著重要的作用，因為dcl2的無效突變體能夠顯著減少無性孢子的產生。

植物和動物病毒由于不斷地演化，能夠編碼產生各種RNA沉默的抑制子來抵抗寄主的抗病毒沉默，通過利用基因沉默檢測的方法能夠鑒別和描述沉默抑制子的活性，在接種的原生質體中沉默抑制子能夠增強病毒的沉默，促進病毒在植物葉片細胞之間的短距離運動和依賴于韌皮部的長距離病毒運動，就能夠造成系統侵染的組織中造成病癥[6]。當植物受到病毒侵染時，不同的沉默的抑制子是怎樣在沉默的不同階段發揮作用的；沉默抑制子在抑制沉默過程中是不是起直接作用而引起發病癥狀，是Ding等人討論的問題。Ding等人在煙草和擬南芥中通過“交叉保護”[7]機制來抵抗CMV的侵染。首先，在擬南芥葉片上接種不含有抑制子2b的CMV，然后一段時間后，當病毒CMV再次侵染時，擬南芥不會感病，無病害癥狀產生。CMV的突變體2b（CMV-△2b）引起的交叉保護不是基因沉默。我們想通過調查分析這種機制和基因沉默的發生過程是不是有關聯的，因為基因沉默過程中能夠編碼四種DCL蛋白，其中的dcl2、dcl3和dcl4參與到抗病毒沉默的過程中。在野生型擬南芥植物中，侵染CMV-△2b是不會產生病癥的，受到交叉保護的機制，當CMV-2b也侵染此擬南芥時，植株是不會感病的。CMV-△2b對抗CMV-2b所產生的交叉保護反應也可以在dcl2、dcl3或者dcl4突變體中觀察到，而且在dcl2 dcl4雙突變體中其反應更強烈。但是，當侵染擬南芥的CMV-△2b含量很高時，也能夠使植株發病。這種結果說明CMV-△2b與CMV-2b產生的交叉保護機制并不是完全依賴于基因沉默機制，也有可能和病毒之間的競爭有關[8]。另外，研究還發現在布氏錐蟲體內，基因沉默的一種保守途徑是RNA干涉，RNA干涉過程中涉及到兩種核糖核酸內切酶：一個是Dicer蛋白，另外一種是AGO蛋白或者是Slicer蛋白[9]。其中DCL蛋白是RnaseⅢ家族成員，它能夠促使siRNA的產生，從而引起RNA干涉作用。研究還發現，Dicer和DCL蛋白在羧基端都有兩個臨近的區域蛋白分別稱為RNase IIIa和RNase IIIb，這兩種區域的出現在布氏錐蟲DCL蛋白結構中是不尋常的，RNase IIIa是接近氨基端，RNase IIIb卻被定位在酶分子的中心區域，基于這種結構的特性使的dcl RNaseⅢ具有活性。

參考文獻

[1]Naoki Kadotani， Toshiki Murata， Nguyen Bao Quoc， Yusuke Adachi and Hitoshi Nakayashiki. Transcriptional Control and Protein Specialization Have Roles in the Functional Diversification of Two Dicer-Like Proteins in Magnaporthe oryzae. Genetics 180： 1245-1249 （October 2008）.

[2]Lukasz Jaskiewicz and Witold Filipowicz. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2008.

[3]Nicolas Bouche'， Dominique Lauressergues，Virginie Gasciolli and Herve' Vaucheret. An antagonistic function for Arabidopsis DCL2 in development and a new function for DCL4 in generating viral siRNAs. The EMBO Journal （2006） 25：3347-3356.

[4]Isabelle Plante， Laetitia Davidovic， Dominique L. Ouellet， Lise-Andr？ee Gobeil， Sandra Tremblay， EdouardW. Khandjian， and Patrick Provost. Journal of Biomedicine and Biotechnology. Volume 2006， Article ID 64347， DOI10.1155/JBB/2006/64347.

[5]Naoki Kadotani， Hitoshi Nakayashiki ， Yukio Tosa， and Shigeyuki Mayama. One of the Two Dicer-like Proteins in the Filamentous Fungi Magnaporthe oryzae Genome Is Responsible for Hairpin RNA-triggered RNA Silencing and Related Small Interfering RNA Accumulation. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. Vol. 279， No. 43： 44467-44474，2004.

[6]Juan A. Diaz-Pendon， Feng Li，Wan-Xiang Li， and Shou-Wei Ding. Suppression of Antiviral Silencing by Cucumber Mosaic Virus 2b Protein in Arabidopsis Is Associated with Drastically Reduced Accumulation of Three Classes of Viral Small Interfering RNAs. The Plant Cell， Vol. 19： 2053-2063， June 2007.

[7]A. Gal-On and Y. M. Shiboleth. Cross-Protection . Natural Resistance Mechanisms of Plants to Viruses， 261-288.

[8]Heiko Ziebell and John P. Carr. Effects of dicer-like endoribonucleases 2 and 4 on infection of Arabidopsis thaliana by cucumber mosaic virus and a mutant virus lacking the 2b counter-defence protein gene. Journal of General Virology （2009）， 90： 2288-2292.

[9]Huafang Shi， Christian Tschudi and Elisabetta Ullu. An unusual Dicer-like1 protein fuels the RNA interference pathway in Trypanosoma brucei. RNA 2006 12： 2063-2072.