液相色譜?質譜法直接進樣測定水中丙烯酰胺的基質效應

秦迪嵐，羅岳平，田 耘，朱 穎，郭 倩，劉荔彬

湖南省環境監測中心站國家環境保護重金屬污染監測重點實驗室，湖南長沙410019

液相色譜?質譜法直接進樣測定水中丙烯酰胺的基質效應

秦迪嵐，羅岳平，田 耘，朱 穎，郭 倩，劉荔彬

湖南省環境監測中心站國家環境保護重金屬污染監測重點實驗室，湖南長沙410019

采用柱后注射法和前處理后添加法評定高效液相色譜?串聯質譜法（LC?MS?MS）的基質效應，研究了不同色譜條件對水樣丙烯酰胺測定中基質效應的影響，提供了有效削減基質效應的方法，并建立了直接進樣測定水中丙烯酰胺的LC?MS?MS法。研究表明，流動相溶劑強度、添加劑種類及濃度對LC?MS?MS直接進樣測定水中丙烯酰胺的基質效應影響顯著；通過調節流動相溶劑強度和甲酸高度使丙烯酰胺保留時間與基質效應出現的時間段錯開，可避開基質效應；在10%甲醇?90%水流動相中添加0.01%～0.02%甲酸可顯著降低基質效應，對水中丙烯酰胺的檢出限為0.03 μg／L，對自來水、地表水、地下水的加標回收率為96.7%～105%，相對標準偏差為1.7%～6.4%。建立的LC?MS?MS直接進樣法簡便、快速、靈敏度高、定性定量準確可靠，適合水中丙烯酰胺的超痕量分析。

高效液相色譜?串聯質譜；基質效應；丙烯酰胺；水

丙烯酰胺是一種水溶性的小分子有機物，是合成聚丙烯酰胺的單體，而聚丙烯酰胺廣泛應用于水凈化、紙漿加工及管道內涂層等領域。丙烯酰胺具有神經毒性、發育毒性及生殖損害作用，國際癌癥研究中心（IARC）將其列為人類可能致癌物（IIA）［1］。由于飲水是人類攝入丙烯酰胺的一條重要途徑，世界衛生組織（WHO）規定飲用水中丙烯酰胺的最高限量不得超過1 μg／L［2］，中國的限量更低，規定飲用水及地表水源地中其標準限值為0.5 μg／L。目前，水中丙烯酰胺的常用檢測方法有氣相色譜法、氣相色譜?質譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜法?串聯質譜法等［2?5］。氣相色譜法及氣相色譜?質譜法需要溴化衍生，步驟繁瑣，干擾因素多且方法穩定性差；高效液相色譜法前處理簡單，無需衍生化，但靈敏度不夠且易受干擾。高效液相色譜?串聯質譜法以其前處理簡單、抗干擾強、靈敏度高等優點，為實現水中痕量丙烯酰胺的簡便、超靈敏、高選擇性檢測提供了一種強有力的技術手段。

串聯質譜以特異性強著稱，但越來越多的數據表明，質譜檢測同樣需要注意避免基質效應［6?8］。LC?MS?MS的基質效應由共流出的基質與目標物競爭影響接口離子化效率所致，表現為離子抑制或增強作用，是影響LC?MS?MS測定準確度及精密度的主要因素。因此，LC?MS?MS分析時必須考察基質效應［6，9?10］。然而，國內文獻的LC?MS?MS方法驗證中較少考察基質效應［11?13］。由于丙烯酰胺是水溶性的小分子，極性較強，在反相色譜柱上的保留時間較短，極易受到基質效應的影響。因此，抑制基質效應是建立準確可靠的水中丙烯酰胺的LC?MS?MS直接進樣法的必要前提。

采用柱后注射法和前處理后添加法2種方法從不同角度評定LC?MS?MS直接進樣測定水中丙烯酰胺的基質效應，考察不同色譜分離條件對自來水、地表水及地下水樣品基質效應的影響，最大程度地削減基質效應，從而建立適用于水中痕量丙烯酰胺檢測的簡便、靈敏、準確及可靠的LC?MS?MS直接進樣法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC?20A高效液相色譜儀（SHIMADZU），API 3200三重四極桿質譜儀（AB SCIEX，配有電噴霧ESI離子源）。

丙烯酰胺：1 000 μg／L（溶劑甲醇，編號M?8032）；超純水：電阻率為18.2 MΩ·cm；甲醇：TEDIA色譜純；甲酸：ROE色譜純；醋酸銨：ROE色譜純。

1.2 色譜質譜條件

Shim?pack VP?ODS色譜柱（150 mm×2.0 mm，4.6 μm）；流動相為10%的甲醇?90%甲酸水溶液（體積分數0.02%），柱溫40℃，進樣量：10 μl，流速0.3 mL／min。

質譜參數：ESI正離子模式，采用多反應監測（MRM）方式定量，丙烯酰胺的母離子／子離子為72.0／55.0，解簇電壓（DP）為30 V，碰撞能量（CE）為15 V，入口電壓（EP）為7 V，碰撞出口電壓（CXP）為2.5 V，離子噴霧電壓（IS）5 500 V，離子源溫度（TEM）為650℃，氣簾氣流速（CUR）為137.90 kPa，碰撞氣流速（CAD）為34.48 kPa，霧化氣流速（GS1）為275.80 kPa，輔助氣流速（GS2）為344.75 kPa。

1.3 樣品采集與處理

水樣用磨口玻璃器皿采集，采樣時不留頂上空間和氣泡，盡快分析。若不能及時分析，應在4℃冰箱中保存。

分析時，水樣用0.22 μm混合纖維素濾膜過濾后直接上機分析。

1.4 基質效應的評定方法

采用柱后注射法和前處理后添加法2種方法評價LC?MS?MS的基質效應。柱后注射法是一種動態的方法，將注射泵和連接色譜柱的液相系統通過三通接頭與質譜連接（圖 1），注射泵以10 μL／min的速度恒流注射20 μg／L丙烯酰胺標準溶液，不含目標物的水樣經過濾后從自動進樣器按已定的色譜條件進樣，記錄丙烯酰胺在整個色譜循環中響應信號的變化，從而判定基質效應出現的時間與影響程度。

圖1 柱后注射法示意圖

前處理后添加法通過比較經前處理后添加目標物的水樣與目標物純標準品溶液的信號峰峰面積來衡量基質效應的大小，其計算公式為

式中：ME為基質效應，%；A0為目標物純標準品溶液測得的峰面積；A1為水樣經前處理后添加相同濃度的目標物測得的峰面積。當ME大于100%時，基質效應表現為離子增強；而ME小于100%時，基質效應表現為離子抑制。

2 結果與討論

2.1 流動相添加劑種類對于基質效應的影響

首先采用前處理后添加法考察以最常用的甲醇?水作為流動相時LC?MS?MS直接進樣法測定水中丙烯酰胺基質效應的大小。流動相組成根據文獻［14］選擇10%甲醇?90%水；水樣選擇與人類飲水密切相關的自來水、地表水和地下水3類樣品，分別采自分析實驗室、湘江株洲段下游飲用水源地和株洲霞灣港。水樣經0.22 μm微孔濾膜過濾后，添加1.00 μg／L丙烯酰胺，以LC?MS?MS直接上機測定，各加標水樣的色譜圖如圖2（a）所示?？梢姡０返某龇鍟r間在1.81 min，自來水和地表水樣品中丙烯酰胺的峰形較好，但峰面積小于純水樣品，基質效應為80%；地下水樣品在1.2～3.0 min呈現出很強的基質效應，并掩蓋了丙烯酰胺的峰，無法定量。水環境介質尤其是地下水中存在的大量水溶性無機離子與丙烯酰胺難以在C18柱上有效分離，與丙烯酰胺共同流出，影響到電噴霧接口的離子化效率，造成基質干擾。因此，如何抑制基質效應是采用LC?MS?MS直接進樣測定水環境樣品特別是硬度較大的地下水樣品中丙烯酰胺的技術瓶頸。

圖2 采用前處理后添加法比較不同流動相添加劑對水樣基質效應的影響

甲酸、醋酸銨是LC?MS?MS中常用的流動相添加劑，具有調節流動相pH、離子強度和改善峰形等作用。在甲醇?水流動相中分別添加醋酸銨、甲酸，比較2種添加劑對改善基質效應的作用。流動相添加2 mmol／L醋酸銨后各加標水樣的色譜圖如圖2（b）所示?？梢姡詠硭偷乇硭畼悠返幕|效應為95%，但峰面積和信噪比分別下降為添加前的11.9%、33.2%；地下水樣品在1.5～2.4 min呈現較強的基質效應，干擾丙烯酰胺峰，仍難以準確定量。由此可見，添加醋酸銨可以抑制潔凈的自來水、地表水的基質效應，但無法消除離子強度較大的地下水樣品的基質效應，并極大地降低了峰信號。往流動相添加0.1%甲酸后各加標水樣的色譜圖如圖2（c）所示?？梢?，各樣品丙烯酰胺的峰形均很好，峰面積雖下降了56.5%，但信噪比未下降，基質效應為 96% ～109%，表明甲酸的添加顯著抑制了水樣的基質效應，后續實驗選擇甲酸作為流動相添加劑。

2.2 流動相溶劑強度對于基質效應的影響

流動相溶劑強度影響丙烯酰胺的保留時間，甲醇含量越高，丙烯酰胺的保留時間越短，但對樣品中無機離子保留值的影響不大。丙烯酰胺的出峰時間應避開基質效應較強的時間段。首先采用柱后注射法動態分析整個色譜循環的基質效應，各水樣丙烯酰胺信號隨時間的變化曲線如圖3所示。由于注射泵恒速連續泵入等濃度的丙烯酰胺，若無基質效應影響，信號應為一平臺；而基質效應為離子增強時，信號將增大；基質效應為離子抑制時，信號將下降。由圖3可見，各水樣在1.0 min附近出現負峰，由進樣所致，為死時間；純水樣品在此后的色譜周期中信號平穩，無基質效應出現；自來水、地表水樣品在1.6 min附近出現正峰；而地下水樣品在1.5、2.0 min附近分別出現2個正峰。依圖3推斷，當丙烯酰胺保留時間正好位于這些時間段時，將出現較強的基質干擾現象。

圖3 柱后注射法監測水樣的基質效應（流動相為10%甲醇?90%甲酸水溶液，甲酸體積分數為0.1%）

采用前處理后添加法定量考察了不同溶劑強度對各水樣丙烯酰胺保留時間以及基質效應的影響，并驗證基質效應大小與丙烯酰胺保留時間、基質效應發生時間段的相關性，如表1所示。當流動相中甲醇的體積分數為20%時，甲醇含量較高，丙烯酰胺出峰時間較早，為1.6 min，對地表水、自來水樣品分析時，恰處基質效應最強的區域（圖3），基質效應為156%；而地下水的基質干擾略低。當甲醇體積分數為5%時，甲醇含量很低，丙烯酰胺出峰時間推遲至2.0 min，地表水、自來水無基質干擾，但對地下水樣品分析時，恰處基質效應最強的區域（圖3），基質效應為124%。當甲醇體積分數為10%時，丙烯酰胺出峰時間為1.8 min，地表水和自來水樣品無基質干擾，地下水樣品的基質效應略微偏高，為109%。由此可見，通過調節流動相甲醇的含量使丙烯酰胺保留時間與基質效應發生時間錯開，可減小基質效應的影響。綜合來看，在流動相添加0.1%甲酸的情況下，甲醇體積分數為10%時，對于3種實際水樣的整體基質效應最低。

表1 采用前處理后添加法比較流動相不同甲醇含量對基質效應的影響

2.3 甲酸用量對于基質效應和信噪比的影響

在固定流動相甲醇體積分數為10%的情況下，同時采用柱后注射法和前處理后添加法考察不同甲酸添加量對基質效應的影響。柱后注射法展現了基質效應發生時間段隨甲酸用量的變化規律，如圖4所示。隨著甲酸體積分數從0.1%減小到0.01%，各水樣基質效應發生的時間段向后推移，當甲酸體積分數降至0.01% ～0.02%后，基質效應推移至2.0 min后，與丙烯酰胺出峰時間有效錯開，最大程度地消減了樣品的基質干擾。采用前處理后添加法比較甲酸用量對不同水樣基質效應的定量影響，如表2所示。

圖4 采用柱后注射法比較流動相中不同甲酸含量對水樣基質效應的影響

表2 采用前處理后添加法比較不同甲酸含量對基質效應的影響

當甲酸體積分數為0.1%時，地下水樣品出現一定的基質干擾；當甲酸體積分數降至0.05%時，基質效應推移至1.8 min左右，與丙烯酰胺出峰時間重合，各樣品基質效應均有增加；隨著甲酸體積分數降至0.01%～0.02%，各樣品基質效應基本消除；當甲酸的體積分數為0.02%時，各樣品的基質效應為97%～100%，干擾最小，后續實驗確定甲酸體積分數為0.02%。

甲酸的用量還影響檢測靈敏度。由圖5可見，隨著甲酸體積分數從0.1%降至0.01%，峰面積由1.78×103增至2.93×103，信噪比由67增至82。甲酸體積分數為0.01%～0.02%時，對提高檢測的靈敏度是有利的。

圖5 甲酸用量對丙烯酰胺峰面積和信噪比的影響

2.4 標準曲線和檢出限

丙烯酰胺的LC?MS?MS標準色譜圖如圖6所示。將丙烯酰胺標準溶液用純水稀釋，配制成質量濃度為 0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 μg／L的標準系列，以LC?MS?MS直接進樣測定，以峰面積（y）對丙烯酰胺質量濃度（x）繪制標準曲線，回歸方程為y＝4.248x－40.8，相關系數為0.999 9。對 0.10 μg／L的空白加標水樣，經0.22 μm濾膜過濾后以LC?MS?MS測定，重復7次，按照 MDL＝St（n－1，0.99）（在99%的置信區間，t6，0.99＝3.143）計算方法檢出限，結果為0.03 μg／L，可滿足《地表水環境質量標準》（GB 3838—2002）規定的集中式生活飲用水地表水源地丙烯酰胺標準限值的要求。

圖6 丙烯酰胺標準色譜圖

2.5 方法精密度和準確度

將丙烯酰胺標準溶液加入純水及實際水樣中，添加后丙烯酰胺終濃度分別為0.40、1.00、4.00 μg／L，按實驗操作考察丙烯酰胺在純水與自來水、地表水和地下水等樣品中的回收率和精密度，結果如表3所示。

表3 LC?MS?MS直接進樣測定水中丙烯酰胺的準確度與精密度

在純水介質中，方法的加標回收率為96.7%～100%，相對標準偏差為1.9% ～5.8%，準確度和精密度均能滿足實驗要求。該法用于自來水、地表水、地下水等水樣測定的加標回收率為96.8%～105%，相對標準偏差為1.7% ～6.4%，表明方法準確可靠。

3 結論

采用柱后注射法和前處理后添加法評定LC?MS?MS的基質效應，可以判斷基質效應在色譜循環中出現的時間段并對基質效應進行定量分析，據此篩選出適合的流動相添加劑并優化色譜分離條件以提高目標物與基質的分離度，可為減小LC?MS?MS的基質效應提供解決方案。在優化后的色譜條件下，采用LC?MS?MS直接進樣測定水樣中的丙烯酰胺，方法靈敏度高、準確度高、精密度好、方便快捷，可滿足對自來水、地表水、地下水等水樣中痕量丙烯酰胺監測的要求。

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Research on the Matrix Effect in Direct?Injection Liquid Chromatography?Mass Spectrometric Determination of Acrylamide in Water

QIN Di?lan，LUO Yue?ping，TIAN Yun，ZHU Ying，GUO Qian，LIU Li?bin
Hunan Province Environmental Monitoring Centre，State Environmental Protection Key Laboratory of Monitoring for Heavy Metal Pollutants，Changsha 410019，China

An optimized direct?injection high performance liquid chromatography?tandem mass spectrometry（LC?MS?MS）method by diminishing the matrix effect has been developed for detection of acrylamide in water.The influence of different chromatographic conditions on the matrix effect was investigated with the post?column infusion method and the addition?after?pretreatment method.The results indicated that chromatographic conditions such as the solvent intensity of mobile phase and content of the additive in mobile phase had dramatic effects on the matrix effect.The matrix effect could be eliminated by adjusting mobile phase ratio and the species and formic acid content to separate the acrylamide peak from matrix peaks，such as with a mobile phase consisting of 10%methanol and 90%water containing 0.01%?0.02%formic acid.The detection limit of the optimized direct?injection LC?MS?MS method was 0.03 μg／L.The recoveris and relative standard deviations were 96.7%?105%and 1.7%?6.4%respectively for acrylamide in real water samples including tap water，suface water and groundwater. This method is simple，rapid，sensitive and accurate for ultra?trace analysis of acrylamide in water.

high performance liquid chromatography?tandem mass spectrometry；matrix effect；acrylamide；water

X832.02

A

1002?6002（2014）06?0142?06

2013?11?26；

2014?02?19

秦迪嵐（1980?），女，廣西陽朔人，博士，高級工程師.