全氟辛烷磺酸對雄性小鼠睪丸細胞凋亡及相關基因表達的影響

張小梅，丁 寧，劉 超，趙彩虹，裘紅梅

（大連大學 醫學院，遼寧 大連 116622）

全氟有機化合物，是一種持久性有機污染物，尤其是其代表性化合物全氟辛烷磺酸（PFOS）和全氟辛酸（PFOA），具有難溶性、生物蓄積性和沿食物鏈向高位營養級的生物體內富集的作用，已被列為持久性有機環境污染物新成員，其所造成的全球性生態系統污染已成事實。毒理學研究資料證明[1-7]，它們對實驗動物及人類都造成的不只是生殖毒性，還能引起肝臟毒性、神經毒性、心血管毒性、胚胎發育與遺傳毒性、致癌性、免疫毒性等。

我們實驗室前期研究表明，PFOS 通過飲水染毒35 天，結果高劑量組小鼠精子活動率顯著下降，5.0和10.0 mg/kg 組小鼠精子畸形率與陰性對照組比較顯著增加。但對PFOS 的具體作用機制尚不清楚，本實驗通過用不同濃度的PFOS 飲水染毒，觀察不同染毒劑量組雄性小鼠睪丸組織細胞凋亡以及相關基因變化，來探討全氟辛烷磺酸對雄性小鼠的生殖毒性作用的機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立

健康昆明種雄性小鼠，體重18~22 g，由大連醫科大學實驗動物中心提供。飼養一周后，隨機分為5組，每組8 只。飲水染毒，劑量分別為0 mg/kg、1.25 mg/kg、2.5 mg/kg、5.0 mg/kg、10.0 mg/kg，自由攝食，飲水。染毒35 天后摘眼球采血，頸椎脫臼處死大鼠，分離雙側睪丸、附睪等臟器，檢測各指標。

1.2 流式細胞儀檢測凋亡細胞

1.2.1 睪丸單細胞懸液制備

用眼科剪將睪丸組織剪成勻漿狀。加入0.01 mol/L PBS 液10 mL，輕輕吹打均勻。用吸管吸取組織勻漿，用200 目篩網過濾至試管內。離心沉淀（1500 r/min，3~5 min），再用PBS 液漂洗3 次；每次漂洗后800 r/min 離心5 min，除去細胞碎片。用250 目尼龍網過濾，去除聚集的細胞團塊。收集的細胞懸液做細胞計數，總量應不少于1×106個/mL。加少量PBS液用吸管反復吹打，然后用300 目尼龍網過濾，1000 r/min 離心5 min，棄去上清液，用PBS 漂洗2 次，加入冰冷的75%乙醇溶液固定（加入預冷乙醇時應不斷震蕩避免細胞團結成塊），4℃冰箱過夜備用。

1.2.2 流式細胞儀檢測

取上述固定的細胞懸液，離心棄乙醇，用PBS漂洗2 次，2000 r/min 離心5 min，收集(1~5)×105細胞。加入500 μL 的Binding Buffer 懸浮細胞。加入5 μL Annexin V-FITC 混勻后，加入5 μL Propidium Iodide 混勻，室溫避光反應5~10 min。用流式細胞儀檢測，激發波長為488 nm，用FACSDiva Version 6.2.1軟件處理得出結果圖。

1.3 RT-PCR 檢測Bax 和Bcl2 基因表達

（1）睪丸組織總RNA 的提取（Trizol 法）：Trizol劑盒由大連寶生物工程有限公司提供，操作過程嚴格按照說明書進行。

（2）RT-PCR 反應：按照RT-PCR 試劑盒（大連寶生物工程有限公司）操作方法合成cDNA，參照文獻[8]設計合成Bax，Bcl2，FAS，Fal 四對特異性引物，β-actin 作為內參，均由大連寶生物工程有限公司合成（引物信息見表1）。PCR 反應體系為20 μl，1 μL cDNA 模板，3.0 μL 10×PCR-buffer，1.0 μL 10m MdNTPs，1.0 μL 引物(50 ng/μL)，0.5 μL Ampli-Taq聚合酶，13.5 μL ddH2O。PCR 擴增條件如下：先95℃預變性2 s，然后95℃5 s、55℃（Fas 基因為60℃）15 s、72℃10 s，循環40 次，最后72℃延伸5 min。擴增后分別產生101 bp、410 bp、143 bp 、217 bp和110 bp 大小的FAS、Fal、Bax、Bcl2 和β-actin 的DNA 片段。Bax，Bcl-2，Fas，FAL 的PCR 反應結束后,取6 μL 反應液，在含0.5 μg/mL 溴化乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統觀察結果，分析目的基因擴增條帶亮度，讀取亮度值，為進行半定量分析，以β-actin 的亮度值作為參照，得出各個PCR 產物的相對亮度值。

表1 PCR 擴增引物序列、退火溫度及長度

1.4 數據分析

2 結果

2.1 PFOS 對小鼠睪丸組織細胞凋亡的影響

細胞凋亡早期位于細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserin，PS)遷移至細胞外側，流式細胞儀通過Annexin V-FITC 標志暴露于細胞膜上的PS 結合PI 進入損傷細胞膜標記降解DNA 分析凋亡與壞死細胞。在檢測時有4 個亞群包括機械性損傷細胞(Q1：Annexin-/PI+)、凋亡晚期細胞(Q2:Annexin+/PI+)、正常細胞(Q:3：Annexin-/PI-)和凋亡早期細胞(Q4：Annexin+/PI-)被區分(如圖1）。PFOS 飲水染毒，流式細胞儀檢測不同染毒劑量組雄性小鼠睪丸組織細胞凋亡情況（圖所1 示）。可看出，細胞凋亡率隨著PFOS的濃度增加而增加，各劑量組與對照組比較均有顯著性差異（p<0.05）。5.0、10.0 mg/kg PFOS 組小鼠睪丸組織細胞凋亡明顯增多（p<0.01）。

圖1 PFOS 對小鼠睪丸細胞凋亡的影響 （與對照組比較，*p<0.05，**p<0.01）

圖2 PFOS 對小鼠睪丸組織中Bax、Bcl-2mRNA 的表達影響（與對照組比較，*p<0.05,**p<0.01）

2.2 PFOS 對小鼠睪丸細胞Bax 和Bcl-2 表達的影響

Bcl-2 家族成員Bax、Bcl-2 在線粒體損傷引起的凋亡中起重要的調節作用。采用RT-PCR 檢測Bax、Bcl-2 基因mRNA 的表達量，電泳條帶如圖2 所示。從圖2 可看出，10 mg/kg/d PFOS 實驗組小鼠睪丸組織中Bax 基因表達與對照組比較顯著上升（p<0.05）,其他劑量組變化與對照組比較差異無統計學意義（p>0.05）。隨著染毒劑量的增加，Bcl-2 基因表達下降，5.0、10.0 mg/kg/d PFOS 實驗組與對照組相比差異有統計學意義（分別為p<0.05，p<0.01）。

3 討論

目前，人類對PFOA 和PFOS 等全氟有機化合物的環境危害、生物多樣性及人體健康損害的調查研究越來越多，尤其是對哺乳動物的PFOS 毒性進行了較多的實驗研究，發現PFOS 對小鼠、大鼠、家兔和猴子等動物具有一定的生殖發育毒性[4-7]。因此在現有資料的基礎上，本實驗用PFOS 染毒小鼠，通過觀察小鼠體重、流式細胞儀檢測睪丸組織細胞凋亡和RT-PCR 檢測Bax、Bcl-2 基因表達變化等指標，了解PFOS 對雄性小鼠的生殖毒性作用的機制。

凋亡(apoptosis)是一種特殊的受遺傳控制的細胞死亡過程,它在組織的發育和維持過程中扮演著重要角色[9]。本實驗采用雙染色經流式細胞儀分析后，各染毒劑量組小鼠睪丸組織細胞凋亡與對照組相比都有統計學意義（p<0.05）。在5.0、10.0 mg/kg 劑量組中，細胞凋亡總數顯著增加（p<0.01）。在高劑量組中，處于凋亡早期的細胞數與對照組比較有顯著性的變化（p<0.01），提示在本實驗劑量水平下，PFOS 對小鼠睪丸的毒性作用較敏感。細胞凋亡是受Bcl-2 蛋白家族、調節蛋白Apaf-1(凋亡激酶激活因子1)、Caspase 蛋白家族等調控的。Bcl-2 家族包括兩類成員，一類如bcl-2，bcl-xl 等是抑制凋亡發生的，另一類如bax、bak、bcl-xs、bad、bid、bik 等是促進凋亡發生的。bcl-2 位于線粒體外膜，可以與bax 結合形成bcl-2/bax 異二聚體，阻止bax 插入線粒體外膜，保護細胞免受凋亡的損害[10]。bcl-2 和bax 在組織細胞中常協同表達，bcl-2/bax 增大時促進細胞存活，反之則導致細胞死亡[11]。近年來的研究提示，Bcl-2 和Bax這兩種基因均參與了睪丸細胞凋亡的過程[12]。但有報道睪丸熱暴露后，Bax 從細胞質到核周重新分布進而啟動凋亡，并且熱暴露后6 h Bcl-2 的表達明顯升高[13]。還有研究表明隨著雄激素的逐漸戒斷，大鼠睪丸中Bax 和Bcl-2 的表達上調[14]；體外研究還顯示，Bcl-2 是凋亡的主要執行者(例如caspase-3)的底物，在凋亡過程中，caspase-3 可以剪切Bcl-2 的C2 末端，進而消除其抗凋亡活性。而且，Bcl-2 的剪切產物有與Bax 相似的前凋亡活性，通過激活下游caspases片斷而觸發細胞死亡[15]。這些研究顯示在雄性睪丸細胞凋亡中Bcl-2 可能也具有促凋亡作用。

研究結果顯示，PFOS 染毒處理的小鼠，Bax 的表達水平在最高劑量組（10.0 mg/kg）中與對照組比較有顯著性增高，但其他各組與對照組的差異沒有統計學意義。Bcl-2 表達水平雖然是隨著染毒劑量的增加而下降，也只有在5.0、10.0 mg/kg 實驗組中才表現出與對照組比較有顯著性差異，較低的劑量組與對照組在統計學上無差別。說明Bax、Bcl-2 可能參與PFOS 誘導小鼠睪丸組織細胞凋亡的調控過程。

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