犬腹瀉病原菌的分離鑒定及藥物敏感性分析

李淑紅等

摘要：對湖南常德地區5例犬腹瀉病直腸糞便采樣，進行細菌分離鑒定；用世界衛生組織（WHO）推薦的Kirby-Bauer氏法對分離菌株進行藥敏試驗，篩選抗致病菌的敏感藥物。結果表明，5例樣本中分離鑒定出4株沙門氏菌、5株大腸埃希菌，分離率分別為44.44%、55.56%。分離株沙門氏菌對新霉素、卡那霉素、妥布霉素、復方新諾明、慶大霉素等5種藥物敏感，對多黏菌素B、四環素2種藥物中介，對其余10種藥物耐藥；分離株大腸埃希菌對紅霉素、妥布霉素、復方新諾明3種藥物敏感，對卡那霉素、呋喃妥因、多黏菌素B、慶大霉素4種藥物中介，對其余10種藥物耐藥。

關鍵詞：犬；大腸埃希菌；沙門氏菌；分離；藥敏試驗

中圖分類號：S858.292.51 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）04-0170-02

收稿日期：2013-07-19

基金項目：湖南省高校重點實驗室項目（編號：2008）；2011年湖南省“十二五”重點建設學科項目（編號：2011）；湖南省高校創新平臺開放基金（編號：10K043）；湖南省重點實驗室項目（編號：2012）；湖南省科學技術廳計劃項目（編號：2013FJ3018）；湖南省常德市科技局項目（編號：2013NK02）。

作者簡介：李淑紅（1964—），女，山東禹城人，碩士，教授，從事動物科學專業教學與研究。E-mail：wangren6332@163.com。腹瀉是臨床上多種疾病經過中表現的主要癥狀之一，是具有腹瀉癥狀疾病的統稱，可導致犬營養不良、生長發育障礙和工作能力喪失，幼齡犬發生率和死亡率均很高[1]。病犬表現排便次數明顯增多，糞便稀薄如水樣或稀粥樣。由細菌引起犬腹瀉較常見，犬的腸道內有大量潛在的致病菌，但不是每種細菌都與臨床疾病有明確的聯系。引起犬腸道感染的致病菌包括腸致病性大腸埃希菌、無致病性大腸埃希菌、沙門氏菌屬病菌、小腸結腸炎耶爾森菌、彎曲菌屬病菌、毛狀芽孢桿菌、梭菌屬病菌、葡萄球菌和志賀菌屬病菌[2]。其中，以大腸埃希菌最常見，其次為犬沙門氏菌，沙門氏菌病別稱副傷寒，是由沙門氏菌屬細菌引起的人畜共患病[3]。本試驗通過對5例犬腹瀉病糞便進行采樣、分離鑒定、革蘭氏染色鏡檢、生化試驗，并對分離株進行藥敏試驗，篩選抗致病菌的敏感藥物，為臨床用藥和治療犬腹瀉病提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、氫氧化鈉、蒸餾水、無菌水；結晶紫、番紅、碘液、香柏油、二甲苯、95%乙醇等。11種腸埃希菌屬細菌生化編碼鑒定管由浙江省杭州微生物試劑有限公司生產。營養瓊脂（NA）、麥康凱培養基（MAC）、伊紅-美藍培養基（EMB）、SS瓊脂培養基、亞硫酸鉍瓊脂（BS）成品均由浙江省杭州天和微生物試劑有限公司生產；營養肉湯（NB）、革蘭氏染色試劑由微生物實驗室配制。

1.1.2藥敏紙片藥敏紙片為浙江省杭州天和微生物試劑有限公司采用美國NCCLS最新藥敏試驗法規制備的標準厚紙片，直徑6.35 mm，紙片含藥量符合標準。本試驗共選用17種藥物敏感試紙，包括新霉素（新）、羧芐青霉素（羧）、氨芐青霉素（氨）、頭孢拉定（VI）、卡那霉素（卡）、先鋒霉素V（V）、阿莫西林（莫）、四環素（四）、紅霉素（紅）、萬古霉素（萬）、妥布霉素（妥）、復方新諾明（復）、呋喃妥因（呋）、萘啶酸（萘）、鏈霉素（鏈）、慶大霉素（慶）、多黏菌素B（多）。

1.1.3主要儀器電子天平、生物顯微鏡、恒溫培養箱、立式壓力蒸汽滅菌器、干燥箱、無菌操作臺、微量移液器等。

1.1.4病料來源湖南省常德市城西寵物醫院提供5只腹瀉犬，其中有3只絲毛犬、1只中華田園犬、1只小型獵犬。

1.2方法

1.2.1培養基配制營養肉湯的配制：稱量10 g蛋白胨、5 g牛肉膏、5 g氯化鈉，混合溶解于1 000 mL蒸餾水中并煮沸，校正pH值至7.0～7.2，裝于錐形瓶中經121 ℃滅菌 15 min，冷藏備用[4]。營養瓊脂（NA）、麥康凱培養基（MAC）、伊紅-美藍培養基（EMB）、SS瓊脂培養基、亞硫酸鉍瓊脂（BS）成品按說明配制，備用。

1.2.2病料的采集用無菌棉拭子插入病犬直腸，旋轉取其糞便，迅速放入裝有滅菌營養肉湯的5支試管內，封蓋貼標簽，放入37 ℃恒溫箱中增菌培養18～24 h。

1.2.3細菌的分離培養取少量用肉湯培養基培養24 h的菌液，在NA培養基上劃線分離，置于37 ℃恒溫箱中培養 18～24 h，再挑取單菌落在普通瓊脂培養基上劃線分離、培養。如此反復，直到培養基上的菌落特征相同時，再挑取單個菌落涂片，染色并鏡檢[5]，觀察菌體大小、染色特征；并分別接種于EMB、MAC、SS、BS培養基上，觀察菌落生長、形態、顏色、色澤、大小等。

1.2.4生化試驗將疑似大腸埃希菌和沙門氏菌的細菌接種到細菌生化測定成套試劑微量管中，37 ℃恒溫箱培養18～24 h，觀察并記錄結果。

1.2.5藥敏試驗選用17種藥物敏感試紙，采用目前各實驗室廣泛采用的世界衛生組織推薦的紙片瓊脂擴散法（disc agar diffusion）即Kirby-Barere法，挑取1/2個已分離鑒定的菌落接種于含5 mL營養肉湯的試管中，置37 ℃恒溫箱中培養18～24 h，取出，與麥氏標準管進行比較。若肉湯濁度不夠，則繼續培養；若肉湯濁度過高，則用滅菌生理鹽水稀釋調節至與0.5麥氏標準管濁度相同。取直徑90 mm的平皿，瓊脂厚度約4 mm，用移液槍取菌液200 μL于營養瓊脂培養基中心，用刮鏟從中心開始推平菌液，使菌液遍布培養皿的每個角落，用鑷子夾取藥敏紙片，每隔2 cm輕貼于培養基上，完成后于37 ℃恒溫箱中培養18～24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，重復3次，記錄結果[6]。根據被測藥物按常用劑量、給藥時間在體內能達到的血藥濃度將敏感性標準分為3級：敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）。抗菌藥紙片種類、含藥量及判定標準參照文獻[7]（表1）。endprint

2結果與分析

2.1犬腹瀉病腸道細菌分離鑒定結果

自5只病犬分離的細菌在NA、EMB、MAC、SS、BS培養基上的菌落形態特征及涂片染色鏡檢結果見表2。

將分離的菌株按常規方法分別接種于葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、硫化氫、靛基質、乳糖、衛矛醇、苯丙氨酸、尿素、氨對微量生化管中，于37 ℃培養18～24 h，觀察并記錄生化反應結果（表3）。

3結論與討論

藥敏試驗結果表明，在17種抗菌藥物中，沙門氏菌對新霉素、卡那霉素、妥布霉素、復方新諾明、慶大霉素5種藥物敏感，對多黏菌素B、四環素2種藥物中介，對其他10種藥物耐藥。大腸埃希菌對紅霉素、妥布霉素、復方新諾明3種藥物敏感，對卡那霉素、呋喃妥因、多黏菌素B、慶大霉素4種藥物中介，對其他10種藥物產生了耐藥性。犬沙門氏菌和大腸埃希菌產生廣泛的耐藥不敏感現象，可能與近幾年抗生素藥物在臨床上的廣泛應用有關，導致細菌遺傳性狀變異，產生耐藥質粒。在疾病治療中，按規定劑量、規定方法和療程用藥，切勿亂用藥，這是避免耐藥菌株繼續增多的根本方法[8]。因此，在臨床選藥治療犬病時，應根據病情結合藥敏試驗結果合理選藥。根據本次細菌分離及藥敏試驗結果在臨床治療常德地區大腸埃希菌和沙門氏桿菌引起的犬腹瀉病時，可首選妥布霉素藥、復方新諾明、卡那霉素、萘啶酸、慶大霉素、新霉素、紅霉素等對細菌敏感性高的藥物，以提高療效，降低細菌對抗生素耐藥性的產生。

參考文獻：

[1]王代賓，張艷麗，王立芬. 犬腹瀉病的危害及其診治[J]. 養殖技術顧問，2011（10）：138-138.

[2]張麗，肖嘯，沈學文. 犬細菌性腹瀉的細菌分離培養與鑒定[J]. 山東畜牧獸醫，2012，33（6）：1-4.

[3]武守艷，韓一超，陳劍波，等. 犬沙門氏菌病的診治[J]. 中國獸醫雜志，2006，42（6）：18

[4]杜連祥，路福平. 微生物學實驗技術[M]. 北京：中國輕工業出版社，2005.

[5]陸承平. 獸醫微生物學[M]. 北京：中國農業出版社，2001：223-225，215-216.

[6]倪語星. 細菌耐藥性監測與抗感染治療[M]. 北京：人民軍醫出版社，2002.

[7]M100-S14抗微生物藥物敏感性試驗執行標準：第14版信息增刊[S]. 華盛頓：美國臨床和實驗室標準協會，2004.

[8]朱忠珂，范國英，鐘華. 犬大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 黑龍江畜牧獸醫，2012，8（16）：93-94.endprint

2結果與分析

2.1犬腹瀉病腸道細菌分離鑒定結果

自5只病犬分離的細菌在NA、EMB、MAC、SS、BS培養基上的菌落形態特征及涂片染色鏡檢結果見表2。

將分離的菌株按常規方法分別接種于葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、硫化氫、靛基質、乳糖、衛矛醇、苯丙氨酸、尿素、氨對微量生化管中，于37 ℃培養18～24 h，觀察并記錄生化反應結果（表3）。

3結論與討論

藥敏試驗結果表明，在17種抗菌藥物中，沙門氏菌對新霉素、卡那霉素、妥布霉素、復方新諾明、慶大霉素5種藥物敏感，對多黏菌素B、四環素2種藥物中介，對其他10種藥物耐藥。大腸埃希菌對紅霉素、妥布霉素、復方新諾明3種藥物敏感，對卡那霉素、呋喃妥因、多黏菌素B、慶大霉素4種藥物中介，對其他10種藥物產生了耐藥性。犬沙門氏菌和大腸埃希菌產生廣泛的耐藥不敏感現象，可能與近幾年抗生素藥物在臨床上的廣泛應用有關，導致細菌遺傳性狀變異，產生耐藥質粒。在疾病治療中，按規定劑量、規定方法和療程用藥，切勿亂用藥，這是避免耐藥菌株繼續增多的根本方法[8]。因此，在臨床選藥治療犬病時，應根據病情結合藥敏試驗結果合理選藥。根據本次細菌分離及藥敏試驗結果在臨床治療常德地區大腸埃希菌和沙門氏桿菌引起的犬腹瀉病時，可首選妥布霉素藥、復方新諾明、卡那霉素、萘啶酸、慶大霉素、新霉素、紅霉素等對細菌敏感性高的藥物，以提高療效，降低細菌對抗生素耐藥性的產生。

參考文獻：

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[8]朱忠珂，范國英，鐘華. 犬大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 黑龍江畜牧獸醫，2012，8（16）：93-94.endprint

2結果與分析

2.1犬腹瀉病腸道細菌分離鑒定結果

自5只病犬分離的細菌在NA、EMB、MAC、SS、BS培養基上的菌落形態特征及涂片染色鏡檢結果見表2。

將分離的菌株按常規方法分別接種于葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、硫化氫、靛基質、乳糖、衛矛醇、苯丙氨酸、尿素、氨對微量生化管中，于37 ℃培養18～24 h，觀察并記錄生化反應結果（表3）。

3結論與討論

藥敏試驗結果表明，在17種抗菌藥物中，沙門氏菌對新霉素、卡那霉素、妥布霉素、復方新諾明、慶大霉素5種藥物敏感，對多黏菌素B、四環素2種藥物中介，對其他10種藥物耐藥。大腸埃希菌對紅霉素、妥布霉素、復方新諾明3種藥物敏感，對卡那霉素、呋喃妥因、多黏菌素B、慶大霉素4種藥物中介，對其他10種藥物產生了耐藥性。犬沙門氏菌和大腸埃希菌產生廣泛的耐藥不敏感現象，可能與近幾年抗生素藥物在臨床上的廣泛應用有關，導致細菌遺傳性狀變異，產生耐藥質粒。在疾病治療中，按規定劑量、規定方法和療程用藥，切勿亂用藥，這是避免耐藥菌株繼續增多的根本方法[8]。因此，在臨床選藥治療犬病時，應根據病情結合藥敏試驗結果合理選藥。根據本次細菌分離及藥敏試驗結果在臨床治療常德地區大腸埃希菌和沙門氏桿菌引起的犬腹瀉病時，可首選妥布霉素藥、復方新諾明、卡那霉素、萘啶酸、慶大霉素、新霉素、紅霉素等對細菌敏感性高的藥物，以提高療效，降低細菌對抗生素耐藥性的產生。

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[8]朱忠珂，范國英，鐘華. 犬大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 黑龍江畜牧獸醫，2012，8（16）：93-94.endprint