乳鐵蛋白熱穩定性研究

閆序東，王彩云，云戰友

(內蒙古伊利實業集團股份有限公司技術中心，呼和浩特010110)

0 引 言

乳鐵蛋白(LF)對熱敏感，容易變性失活。關于乳鐵蛋白的熱穩定性，已有一些研究報道。HIROAKI等[1]研究了在酸性條件下牛乳鐵蛋白的熱穩定性，發現脫鐵乳鐵蛋白在酸性條件下非常穩定。CELIA等[2]研究了熱對LF抑菌活性的影響，發現85℃保溫10 min的熱處理強度未降低LF的抑菌活性。LUIS等[3]研究發現72℃保溫20 s或135℃保溫8 s的熱處理條件幾乎不影響LF的鐵結合能力，然而兩種溫度下更長的時間則會降低鐵結合能力。MARIE等[4]研究了不同鐵飽和度的LF在巴殺和UHT后的結構和抑菌活性變化，發現UHT造成LF的完全變性和抑菌性喪失，而巴殺對LF的抑菌活性沒有影響。

通過文獻報道可知，乳鐵蛋白對熱敏感，在其生產及應用過程中應注意保護其活性，以免失去功效。但以往的研究結果存在一些分歧甚至矛盾，因此有必要研究LF在乳制品加工常用熱處理條件下的熱穩定性，評價LF在實際加工過程中的結構和生物活性變化。

1 實 驗

1.1 材料與設備

乳鐵蛋白，E.coli K99，ANS試劑，DTNB； 磷酸二氫鈉、SDS、丙烯酰胺等均為國產分析純試劑。

UHT設備，水浴恒溫振蕩器，熒光分光光度計，電泳儀，TV-1810紫外-可見分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 熱處理

以蒸餾水溶解乳鐵蛋白，配制為40 g/L(質量濃度)的乳鐵蛋白溶液，進行不同強度的熱處理，熱處理條件分別為：63 ℃/30 min，72 ℃/15 s，85 ℃/15 s，85℃/10 min，95 ℃/5 min和 138 ℃/4 s，138 ℃/4 s的受熱條件以UHT設備處理，其他受熱條件在水浴鍋中處理。熱處理后將乳鐵蛋白溶液冷凍備用。

1.2.2 濃度測定

采用還原SDS-PAGE和非還原SDS-PAGE分別測定熱處理前后的乳鐵蛋白質量濃度變化。非還原SDS-PAGE與還原SDS-PAGE相比未加β-巰基乙醇。分離膠質量分數15%，濃縮膠質量分數5%，上樣量3.3 μg，恒壓120V。

1.2.3 表面疏水性測定

ANS方法[5]，以0.01 mol/L，pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液將乳鐵蛋白配制成0.01～0.4 mg/mL的濃度，取不同濃度的蛋白溶液3 mL，加入40 μL的ANS溶液(以濃度為0.1 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液配制的濃度為8 mmol/L的ANS溶液)，以熒光分光光度計在380 nm激發波長、480 nm發射波長，狹縫均為5 nm的條件下測定熒光值，以熒光值對蛋白質濃度做出曲線并外推至蛋白濃度為0，曲線初始部分的斜率即為蛋白質分子的表面疏水性指數。

1.2.4 游離巰基測定

參考BEVERIDGE的方法[6]，將LF蛋白樣品進行適度稀釋，取稀釋樣品1 mL加入2.0 mL Tris-甘氨酸緩沖溶液(pH8.0)和0.02 mL的Ellman試劑(采用Tris一甘氨酸緩沖溶液(pH8.0)配制的濃度為4 g/L DTNB，25℃保溫5 min，412 nm下測定吸光度值。以不加樣品，而加Ellman試劑為空白，以不加Ellman試劑，而加樣品溶液測其混濁度，巰基量的計算：

-SH(μmol/g)=(75.53×A412×D)/C，

式中：A412=加DTNB時樣品的吸光度-不加DTNB時樣品的吸光度；D為稀釋倍數；C為樣品固形物質量分數。

1.2.5 鐵結合能力測定

參考盧蓉蓉方法[7]，配制質量分數為2%的LF溶液，取0.9 mL此溶液，與0.1 mL新鮮配制濃度為0.1 mol/L的NaHCO3溶液混合，并與1.0 mL濃度為0.6 mmol/L的Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O的(含0.01 mol/L的HCl)溶液混合。在25℃下反應10 min，于465 nm處測定吸光值A。因為質量分數為1%鐵飽和的LF(Fe-LF)的A465為0.57，因此鐵結合能力=A/0.57×100%。

1.2.6 抑菌性測定

將E.coli K99活化兩代，第一代活化16 h，第二代活化1 h，再稀釋10倍備用。將熱處理后的40 mg/mL乳鐵蛋白溶液融化進行測試，8.5 mL緩沖蛋白胨水中加入0.5 mL乳鐵蛋白溶液和1 mL菌液，于37℃，65 r/min水浴振蕩搖床中培養，每2 h測定一次600 nm下的OD值，培養至第24 h時進行平板計數。

2 結果與討論

2.1 濃度

熱處理前后LF的還原和非還原電泳結果如圖1所示。

由圖1可以看出，非還原電泳可以很好的反映乳鐵蛋白受熱損失的情況。63℃(30 min)的熱處理后，LF形成了少量的聚集體，這種聚集體不能進入分離膠，但可以進入濃縮膠。72℃(15 s)的熱處理條帶與未熱處理的LF幾乎相同，這種熱處理條件對LF造成的損害是最小的。85℃(15 s)熱處理后LF也形成了少量不能進入分離膠的聚集體，但聚集體的數量少于63℃(30 min)的。 而85 ℃(10 min)和95 ℃(5 min)熱處理后，LF除形成了不能進入分離膠的聚集體外，還形成了更大的不能進入濃縮膠的聚集體，95℃(5 min)對LF造成的損失明顯高于85℃(10 min)。UHT后LF幾乎全部形成了很大的聚集體，這種聚集體全部不能進入濃縮膠，而且形成這種聚集體的作用不能被β-巰基乙醇所破壞，因此還原電泳圖中UHT條帶與非還原電泳中相似。UHT外的其他熱處理形成的LF聚集物都能被β-巰基乙醇還原為單體蛋白。

圖1 熱處理前后LF的SDS-PAGE

2.2 表面疏水性

熱處理前后LF的表面疏水性如圖2所示。

圖2 熱處理前后LF的表面疏水性

蛋白質的表面疏水性對于蛋白質的溶解性、乳化起泡能力具有十分重要的作用。由圖2可以看出，熱處理對于LF的表面疏水性影響很大，熱處理有助于LF表面疏水性的增大，說明熱處理后LF結構發生變化使更多原本折疊埋藏在分子內部的疏水區域暴露到分子表面。

2.3 游離巰基

熱處理前后LF的游離巰基數量如圖3所示。

圖3 熱處理前后LF的游離巰基數量

天然未變性的LF分子內有17個二硫鍵，但沒有游離的巰基。由圖3可以看出，85℃(10 min)的熱處理后LF游離巰基數量略有上升，95℃(5 min)和UHT后，游離巰基數量增加很多，其他熱處理條件下，LF的游離巰基數量與未加熱前近似。這表明比較強烈的熱處理打斷了LF分子內的二硫鍵從而釋放出游離的巰基，因為二硫鍵對于維持蛋白質的二級和三級結構非常重要，因此可以判斷二硫鍵的破壞必然伴隨著LF分子結構的巨大改變。

2.4 鐵結合能力

熱處理前后LF的鐵結合能力如圖4所示。

圖4 熱處理前后LF的鐵結合能力

由圖4可以看出，溫度85 ℃(10 min)、95 ℃(5 min)和UHT處理后，LF的鐵結合能力受到明顯損害，其他熱處理條件下鐵結合能力下降不大。圖4中顯示的UHT處理后鐵結合能力反而高于95℃(5 min)是因為UHT處理后LF溶液渾濁度增加很多，因此對于鐵結合能力的檢測結果干擾較大。

2.5 抑菌性

熱處理前后LF對大腸桿菌K99抑制作用的OD曲線如圖5所示，平板計數得到抑菌率如圖6所示。

圖5 熱處理前后LF對大腸桿菌K99抑制作用的OD曲線

圖6 熱處理前后LF對大腸桿菌K99抑制作用的24 h抑菌率

由圖5和圖6可以看出，常規的乳制品巴殺操作對乳鐵蛋白抑菌活性的影響不大，而85℃(10 min)及更強的熱處理強度會降低乳鐵蛋白的抑菌活性。

3 結束語

乳鐵蛋白是熱敏性物質，乳制品加工中的各種常規熱處理都會或多或少造成乳鐵蛋白結構或生物活性的改變，乳鐵蛋白所遭受的熱處理強度越高，則變性和失活的程度也越高。特別是乳鐵蛋白在遭受UHT等強熱處理后，其特征電泳條帶損失很大，自由巰基和表面疏水性變化也指示乳鐵蛋白結構發生了顯著改變，同時鐵結合能力和抑菌活性這兩大乳鐵蛋白主要的生物活性也降低很多。但巴氏殺菌對乳鐵蛋白結構及生物活性的影響較小。因此在乳鐵蛋白生產和應用過程中，應該盡量減少乳鐵蛋白受到強度較高的熱處理，以保證乳鐵蛋白的優良生物活性得到較好保留。

[1]HIROAKI A,HITOSHI S,HIROSHI M,et al.Heat Stability of Bovine Lactoferrin at Acidic pH[J].J.Dairy Sci.,1991,74(1):65-71.

[2]CELIA C,CARMEN R,EDUARDO C,et al.Effect of Heat Treatment on the Antibacterial Activity of Bovine Lactoferrin Against Three Food Borne Pathogens[J].International Journal of Dairy Technology,2010,63(2):209-215.

[3]LUIS M,LOURDES S,DENIS R H,et al.Thermal Denaturation of Human Lactoferrin and Its Effect on the Ability To Bind Iron[J].J.A-gric.Food Chem,1998,46:3964-3970.

[4]MARIE A P,ULLA S,ALUGUPALU R K,et al.Thermal Behavior of Bovine Lactoferrin in Water and Its Relation to Bacterial Interaction and Antibacterial Activity[J].J.Dairy Sci.,1993,76:3711-3720.

[5]AKIO K,SHURYO N.Hydrophobicity Determined by a Fluorescence Probe Method and Its Correlation with Surface Properties of Proteins[J].Biochimica et Biophysica Acta,1980,624:13-20.

[6]BEVERIDGE T,TOMA S J,NAKAI S.Determination of SH-And SS-groups in Some Food Proteins Using Ellman’s Reagent[J].Journal of Food Science,1974,39:49-51.

[7]盧蓉蓉.乳鐵蛋白的分離、純化及其生物活性功能[D].無錫:江南大學,2003.