山羊乳酪蛋白酶解條件優化及其抗菌活性研究

蘇晉文，李志成，任嬌，郝潔，付芒娟

(西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌712100)

0 引 言

抗菌肽是存在于生物體內能抵抗外界微生物侵害，消除體內突變細胞的一類由基因編碼或經大分子蛋白質水解產生的小分子多肽[1]，具有廣譜抗細菌、真菌、病毒、和寄生蟲的活性，且不易產生耐藥性[2-3]，是一類具有巨大發展潛力的新型抗菌物質。

乳酪蛋白在酶解過程中可以產生多種生物活性肽[4-5]，在牛乳酪蛋白酶解物中已經發現多種抗菌肽[6-8]。山羊乳是北方僅次于牛乳的第二大乳源，山羊乳酪蛋白和牛乳酪蛋白在蛋白質質量分數、氨基酸序列等方面存在較大差異[9-11]，以山羊乳酪蛋白為原料同樣能獲得多種活性肽[12-13]。目前對山羊乳酪蛋白抗菌肽的研究鮮見報道。本研究以山羊乳酪蛋白為原料，探索山羊乳酪蛋白抗菌肽的最適酶解條件，為山羊乳的高值化利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無抗山羊乳，購于西北農林科技大學畜牧場；沙門氏菌(Salmonella LT2)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 26111)、大腸桿菌(Escherichia coli ACTT25922)，西北農林科技大學食品科學與工程學院保存。

考馬斯亮藍G-250，胰蛋白酶(80 000 U/g)，堿性蛋白酶(8 000 U/g)，木瓜蛋白酶(40 000 U/g)，中性蛋白酶(40 000 U/g)，胃蛋白酶(3 000～3 500 U/g)；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1700雙光束紫外光分光光度計，PK121R型低溫冷凍離心機，水浴鍋，SB5200DT超聲清洗機，ES315高壓蒸汽滅菌鍋，PYX-DHS-40×50-BS-П隔水式恒溫培養箱(HES-380)；SW-CJ-1F超凈工作臺。

1.3 乳酪蛋白制備

新鮮無抗山羊乳4℃條件下，5 000 r/min離心20 min脫脂，離心后的溶液用濃度為2 mol/L的HCl溶液調節pH值至4.3，在40℃水浴鍋中靜置30 min沉淀酪蛋白，沉淀完全后5 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用濃度為50 mmol/L(pH=4.4)HAc-NaAc緩沖液洗滌所得沉淀2～3次，洗滌后5 000 r/min離心10 min，即得酪蛋白粗品。

1.4 酪蛋白酶解液制備

稱取適量酪蛋白于三角瓶，加濃度為0.1 mol/L的NaOH助溶，定容，沸水浴加熱10 min，殺菌。冷卻后，放入60℃的恒溫水浴鍋中，等到酶解液溫度與水浴鍋溫度一致，調節溶液pH值至最適，并準確加入蛋白酶。水解過程不斷滴加濃度為1 mol/L的NaOH，維持反應體系pH值恒定，到達規定酶解時間后，沸水浴加熱滅酶10 min，冷卻離心，取上清液備用[14]。

1.5 蛋白酶的篩選

[15]和[16]中的方法，分別采用中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶在表1所示的條件下酶解山羊乳酪蛋白，根據酶解液對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌抑菌圈直徑大小篩選出抑菌效果最好的蛋白酶。

表1 5種蛋白酶的酶解條件

1.6 酶解條件優化

1.6.1 單因素實驗

(1)時間的確定。在酶解溫度為60℃，pH值為5.5，加酶量為 4 500 U/g，底物濃度為60 g/L的反應體系下，以時間為0.5 h和1.5～5.5 h做單因素實驗，以酶解液抑菌圈直徑大小為指標，確定適宜酶解時間。

(2)加酶量的確定。選用適宜酶解時間，在酶解溫度為60℃，pH值為5.5，底物質量濃度為60 g/L的反應體系下，按 2 000 U/g和3 000～7 000 U/g加入木瓜蛋白酶，以酶解液抑菌圈直徑大小為指標，確定適宜酶用量。

(3)底物質量濃度的確定。選用適宜酶用量和酶解時間，分別在底物質量濃度為4，6，8，10，12 g/L的條件下酶解酪蛋白，以酶解液抑菌圈直徑大小為指標，確定適宜底物質量濃度。

(4)pH值的確定。選用適宜酶用量、酶解時間和底物質量濃度，分別在pH值為3，4，5，6，7和8條件下進行酶解，以酶解液抑菌圈直徑大小為指標，確定適宜酶解pH值。

1.6.2 正交實驗

根據單因素實驗得到的最適條件，以底物濃度、加酶量、pH值、酶解時間為實驗因素，按照L9(34)進行正交實驗，以酶解液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑為指標，確定木瓜蛋白酶酶解羊乳酪蛋白的最佳工藝條件。

1.7 檢測指標及方法

1.7.1 酪蛋白質量分數測定

采用微量凱氏定氮法[17]測定蛋白質質量分數。測得山羊乳酪蛋白蛋白質質量分數為18.78%。

1.7.2 抑菌活性測定

本研究指示菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。

(1)培養基制作。稱取牛肉膏5.00 g，胰蛋白胨10.00 g，NaCl為5.00 g， 瓊脂10～12 g， 蒸餾水加熱溶化，冷卻，定容至1 000 mL，調節pH值為7.2～7.4。

(2)菌種活化。無菌操作條件下用接種環將斜面保藏的菌種接種于滅好菌的營養瓊脂斜面上，37℃培養24 h，連續接種兩代，于4℃冰箱中備用。

(3)菌懸液的制備及活菌計數。無菌條件下，用生理鹽水將活化的菌種從斜面洗下，震蕩均勻進行逐級稀釋，取100 μL進行平板涂布，37℃倒置培養培養16～24 h，進行菌落計數，計算原液濃度。

(4) 標準曲線繪制。 將原液按2，3，4，6，8，9，10，50，100的倍數稀釋，在560 nm處測定各稀釋液OD值，以不同稀釋度的菌落數為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。對照標準曲線吸光度，調整菌液濃度最終為107mL-1，3種菌吸光值與菌液濃度標準曲線如圖1所示。

(5)抑菌活性測定

參考文獻[18]和[19]中的方法，測定試樣對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑。具體方法為：在無菌條件下，取107mL-1的菌液100 μL均勻涂布于營養培養基上，在超凈工作臺中靜置20 min，待菌液吸收后用無菌的外徑為8 mm的小鋼管在瓊脂平板上挖洞，每孔加入90 μL樣品溶液，水平置于4℃冰箱中約2 h讓樣品溶液完全擴散，再移至37℃恒溫培養箱中培養15～24 h，觀察結果，有抑菌圈出現的樣品，以游標卡尺量其取抑菌圈的直徑。

1.8 數據處理

采用SPSS19.0軟件進行結果統計分析，結果以平均值±標準偏差(±s)的形式表示，每組試驗進行3～6個重復，必要時進行方差顯著性比較。

2 結果分析

2.1 山羊乳酪蛋白水解酶的篩選

5種蛋白酶酶解山羊乳酪蛋白酶解液對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最佳抑菌效果見表2。

由表2可以看出，陽性對照青霉素對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有顯著抑制作用，堿性蛋白酶酶解物對大腸桿菌，中性蛋白酶酶解物對沙門氏菌，胰蛋白酶酶解物對金黃色葡萄球菌均無抑菌活性。相比而言，木瓜蛋白酶酶解物對3種菌的抑菌效果均較好，與其他四種酶解物對3種菌的抑菌圈直徑存在顯著性差異(P<0.05)。因此，確定木瓜蛋白酶為山羊乳酪蛋白的最佳水解用酶。

圖1 菌液吸光值與其濃度的標準曲線

表2 山羊乳酪蛋白酶解物的抑菌效果(±s，n=3)

表2 山羊乳酪蛋白酶解物的抑菌效果(±s，n=3)

注：青霉素質量濃度為1 250 mg/L；小寫字母不同表示差異性顯著(P<0.05)；瓊脂孔直徑8.0 mm；-為沒有抑菌圈。

菌株大腸桿菌沙門氏菌金黃色葡萄球菌中性蛋白酶酶解物8.2±0.1c―8.3±0.2c胰蛋白酶酶解物8.4±0.2c 8.2±0.2c―木瓜蛋白酶酶解物9.3±0.2b 9.4±0.1b 9.4±0.3b抑菌圈直徑/mm菌株大腸桿菌沙門氏菌金黃色葡萄球菌堿性蛋白酶酶解物―8.4±0.1c 8.3±0.2c胃蛋白酶酶解物8.6±0.1c 8.5±0.2c―生理鹽水―――青霉素40.3±0.5a 43.3±0.5a 43.0±1.0a抑菌圈直徑/mm

2.2 木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的單因素實驗

2.2.1 酶解時間

在酶解溫度為60℃，pH 值為5.5，加酶量為4 500 U/g，底物濃度為60 g/L的反應體系下，改變酶解時間，不同酶解時間對酶解液抑菌效果的影響結果如圖2。

圖2 時間對山羊乳酪蛋白酶解物抑菌性影響

由圖2可以看出，在2.5 h之前，隨著時間的延長，酶解液對3種菌的抑菌圈直徑逐漸增大，說明酶解時間小于2.5 h，酪蛋白沒有被完全水解，隨著水解時間的延長水解度增加，具有活性的多肽濃度不斷升高；而2.5 h之后，抑菌圈的直徑隨時間延長而減小，可能是因為酪蛋白被完全水解后，具有抑菌活性的多肽被繼續酶解成不具抗菌活性小肽，使原來生成的抗菌肽的量減少。2.5 h時抑菌效果達到最高，說明此時酶解液中抗菌肽濃度最高，為最佳酶解時間。

2.2.2 加酶量的影響

在給定條件酶解溫度60℃，底物質量濃度60 g/L，酶解時間2.5 h，pH值為5.5時，加酶量對山羊乳酪蛋白酶解物抑菌活性影響如圖3所示。

圖3 加酶量對山羊乳酪蛋白酶解物抑菌性影響

由圖3可以看出，加酶量在2 000～5 000 U/g之間，酶解液對3種菌的抑菌圈直徑隨加酶量的增加而增大，在5 000 U/g之后，抑菌圈直徑隨加酶量的增加而減小。加酶量在5 000 U/g之前，隨著酶用量的增加，酶與底物的比例逐漸增大，單位時間內木瓜蛋白酶結合酪蛋白并催化反應生成的抗菌肽的量也逐漸增多；在5 000 U/g之后，隨著加酶量的增大，體系內開始形成酶多底物少的局面，一方面，蛋白酶之間形成競爭關系，使酶解程度降低，另一方面未能與酪蛋白結合的酶會酶解水解產物，使抗菌肽的量減少，從而降低抑菌活性。加酶量為5 000 U/g時對3種菌的抑菌效果達到最高，為最適加酶量。

2.2.3 底物質量濃度的影響

在酶解溫度為60℃，加酶量5 000 U/g，pH值為5.5的反應體系下，酶解山羊乳酪蛋白2.5 h，底物質量濃度對山羊乳酪蛋白酶解物抑菌活性影響如圖4所示。

圖4 底物質量濃度對山羊乳酪蛋白酶解物抑菌性的影響

由圖4可以看出，在底物質量濃度為40～80 g/L時，酶解物對3種菌的抑制作用隨底物質量濃度的增加而增大，根據單底物酶促反應動力學理論，底物質量濃度較低時，酶解液水解程度隨底物質量濃度增加而增大，水解產生的具有抗菌活性的多肽濃度增大，酶解液對3種菌抑菌作用也較大；而在底物質量濃度大于80 g/L時，抑菌圈直徑減小，說明當底物質量濃度超過80 g/L后，體系開始出現底物抑制現象。因此，以80 g/L為最適底物質量濃度。

2.2.4 pH值的影響

在酶解溫度60℃，酶解時間2.5 h，加酶量5 000 U/g和底物質量濃度為80 g/L的條件下，pH值對酶解物抑菌活性的影響如圖5所示。

由圖5可以看出，隨著反應體系內pH值的增大，酶解物對3種菌的抑菌圈直徑呈現先增大后減小的趨勢，在反應體系中，酶解酪蛋白的水解酶的空間構象受pH值的影響較大，在過酸過堿的環境下，水解酶的空間構象會改變使其降低其活性，從而生成的抗菌肽的量也降低。因此，反應體系最適合pH值確定為6.0。

圖5 pH值對羊乳酪蛋白酶解液抑菌活性的影響

2.2.5 木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的正交實驗

根據單因素實驗得到的最適條件，用L9(34)正交實驗對加酶量、底物濃度、酶解時間和pH值進行正交實驗，通過正交實驗確定酶解山羊乳酪蛋白的最佳工藝條件。正交實驗的設計與結果分析如表3所示。

表3中，R值最大的為pH值，其次為加酶量，然后是酶解時間，底物質量濃度R值最小。可見，實驗中各因素對酶解產物抑菌活性的影響的主次順序為D＞B＞A＞C，即pH值＞加酶量＞酶解時間＞底物質量濃度。ki值顯示木瓜蛋白酶酶解山羊乳酪蛋白的最佳工藝組合為A1B2C2D2，即在60℃下，酶解時間為1.5 h，加酶量為5 000 U/g，底物質量濃度8%，pH值為6.0，恰為正交實驗第2組。

表3 木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的正交設計與結果分析

2.3 討論

(1)山羊乳酪蛋白的木瓜蛋白酶酶解物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈分別為10.5 mm，10.3 mm和10.5 mm，這與一些牛乳酪蛋白酶解物的抑菌圈相比，直徑比較小，如胡志和等人利用胰蛋白酶解牛乳酪蛋白，獲得抗菌肽對大腸桿菌的抑菌圈直徑為19.5 mm[7]；付莉等人利用中性蛋白酶水解酪蛋白所得抗菌肽對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為21.93 mm[20]。這可能與本試驗用于制備的酪蛋白為粗品(酪蛋白濃度為18.78%)，酶解底物純度較小有關。

(2)熊清權等人[21]利用木瓜蛋白酶酶解牛乳酪蛋白制備抗菌肽，確定酶解的最佳時間為4.5 h，而本試驗最佳酶解時間為1.5 h，相差較大，這可能與山羊乳酪蛋白與牛乳酪蛋白自身性質有關，Jainska研究表明，在體外用胰蛋白酶酶解酪蛋白，羊乳酪蛋白有96%被水解，而牛乳酪蛋白只水解了70%～90%[22]；在人的胃液和十二指腸液的作用下，30 min內只有23%的羊乳酪蛋白未被水解，而牛乳酪蛋白還有83%未被水解[23]。說明羊乳酪蛋白比牛乳酪蛋白存在更大的溶解性，更易被酶解。

表3木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的正交設計與結果分析。

(3)單因素試驗和正交試驗結果相比，酶解時間不一致，單因素試驗時最適酶解時間為2.5 h，而正交試驗為1.5 h，這是因為在做單因素試驗時，首先考慮了酶解時間，加酶量、pH值和底物質量濃度均為選酶時設定的初始條件，也就是說2.5 h是在其他因素為初始條件下得到的較好的結果，與做正交試驗時各因素的優化條件不一樣，優化試驗證明，酶解1.5 h，酶解物抗菌效果更佳。

3 結 論

(1)木瓜蛋白酶是山羊乳酪蛋白的最佳水解用酶，其酶解物對沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強。

(2)木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的最佳工藝為加酶量為5 000 U/g，底物質量濃度80 g/L，pH值為6.0，在60℃酶解1.5 h，所得酶解液對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的抑菌圈直徑均在10.5 mm左右。

參考文獻：

[1]陳軼群,曹云鶴.抗菌肽研究進展 [J].中國畜牧雜志,2009,45(11):60-64.

[2]黎觀紅,洪智敏,賈永杰等.抗菌肽的抗菌作用及其機制 [N].動物營養學報,2011,23(4):546-555.

[3]劉誠,黎滿香,盧帥等.抗菌肽研究進展[J].動物醫學進展,2011,32(3):94-99.

[4]董開發,謝明勇.乳源性生物活性肽 [J].中國食品學報,2004,4(4):86-91.

[5]黎觀紅,張錦華,瞿明仁等.乳酪蛋白源抗菌肽---結構、功能及應用[J].中國食品添加劑,2010,03:207-214.

[6]RECIO I,VISSER S.Identification of two distinct antibacterial domains with in the sequence of bovine αs2-casein [J].Biochim Biophys acta,1999,1428(2-3):314-326

[7]胡志和,龐廣昌,陳慶森,等.不同條件下水解酪蛋白所得到的抗菌肽抑菌效果比較[J].食品科學,2003,24(2):130-133.

[8]BIRKEMO G A,S'ULLIVAN O,ROSS R P,et al.Antimicrobial activity of two peptides casecidin15 and 17,found naturally in colostrum.Appl Microbiol,2009,106(1):233-240.

[9]童偉,李志成,熊清權,等.牛乳酪蛋白抗氧化乳基料的制備及其分離純化[J].食品科學,2013,34(6):33-36.

[10]MARTIN P,FERRANTI P,LEROUX C,et al.None-bovine caseins quantitative variability and molecular diversity[J].Advanced Dairy Chemistry vol.1:Proteins,2003,3rded:b 277-318.

[11]TOWNEND R,KUMOSINSKI,TIMASHEFF S N,et al.The circular dichroism of variants of β-lactoglobulin[J].Biol chem,1967,242:4538-4543.

[12]黃金海,陳春芳,薛照輝,等.山羊酪蛋白不同酶解產物特性的研究[J].食品工業科技,2009,30(1):120-123.

[13]LI Z,JIANG A,YUE T,et al.Purification and identification of five novel antioxidant peptides from goat milk casein hydrolysates.Journal of Dairy Science,2013,96(7).:4242-4251.

[14]李志成,蔣愛民,熊清權,等.山羊乳酪蛋白酶解物的制備及其體外抗氧化活性研究[J].食品科學,2011,32(23):82-86.

[15]翟青新,張源淑,哈惠.乳源抗菌肽的分離純化及部分性質的研究[J].藥物生物技術,2006,13(06):422-425.

[16]薛培宇,代永剛,南喜平,等.響應面法優化酪蛋白抗菌肽的制備工藝[J].食品科技,2011,36(1):5-8.

[17]中華人民共和國衛生部,2010.GB5009～2010食品安全國家標準食品中蛋白質的測定[S].北京:中國標準出版社.

[18]陳青,張源淑,王金生,等.牛乳酪蛋白來源新型抗菌肽抗菌活性的初步研究[J].畜牧與獸醫,2005,37(8):38-39.

[19]金莉莉,丁忠福,王秋雨.中國林蛙皮抗菌肽提取條件的優化研究[J].食品科學,2008,29(10):223-227.

[20]付莉,王冰.中性蛋白酶制備酪蛋白抗菌肽的研究[J].中國農學通報,2012,28(27):283-289.

[21]熊清權,李志成,童偉,等.牛乳酪蛋白初級抗菌肽粉乳基料的制備[J].乳業科學與技術,2012,35(2):12-16.

[22]JAINSKA B.The comparison of pepsin and try sin action on goat,cow,mare and human caseins[J].Roze Akad Med Bialymst,1995,40(3):486-93.

[23]ALMAAS H,CASES AL,DEVOLD TG,et al.In vitro digestion of bovine and caprine milk by human gastric and duodenal enzymes[J].Int Dariy J,2006,16(9):961-968.