pH對魚腥藻和普通小球藻生長競爭的影響

陳家長 ，王菁，裘麗萍，孟順龍，范立民，宋超

1. 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心//中國水產科學研究院內陸漁業生態環境與資源重點開放實驗室，江蘇 無錫 214081；

2. 南京農業大學漁業學院，江蘇 無錫 214081

水體富營養化和有害藻類爆發性生長已經成為制約我國水產養殖業健康發展的關鍵因素之一。隨著我國水產養殖集約化程度的提高以及人工配合飼料的普遍使用，生產能力與養殖效益有了大幅度的提高，同時也帶來了較為嚴重的負面影響：養殖區域水體的污染、病原生物大量繁殖、生態環境惡化、生物多樣性遭到破壞（Habersack等，2014），甚至會影響到周邊地區的環境（蘇雅玲和鄧一榮,2013；趙風斌，2012；Lei等，2014）。

浮游植物是水生態系統的初級生產者，其種群變動和群落結構直接影響水生態系統的結構和功能（孟順龍，2013）。浮游植物間也存在著競爭現象，各種環境條件，如光照、溫度、營養鹽等，對競爭的結果具有重要影響（Fl?der等，2006；Zhang等，2013）。

普通小球藻和魚腥藻是池塘養殖水體中常見的藻類，其中普通小球藻能為好氧菌提供氧氣，使之將復雜的有機物質分解為簡單的無機物，達到對富含養分的廢水進行資源化處理的目的（胡開輝等,2006）；同時小球藻還是魚類的優良餌料，且對水體中的氮磷有一定的去除作用（余云龍等，2012；劉淑坡和李飛，2012）；魚腥藻是富營養化水體和養殖水體中主要水華藻之一。盡管目前有關小球藻和魚腥藻的研究較多（鄭曉宇等，2012；Zhai等，2009；Zhu等，2013），但這些研究大多是探討環境因素對單一藻種生長特性的影響，而有關普通小球藻和魚腥藻種間競爭的報道并不多見。為此，本研究選用淺水湖泊（太湖等）以及養殖池塘中常見有益藻——普通小球藻和常見有害藻——魚腥藻為試驗藻種，探究不同pH下，普通小球藻和魚腥藻的種間競爭，以期揭示水體中常見藻類的生長過程及其與pH的相互關系，為水產養殖過程控制（曹煜成等，2012）和精準培水技術的研究，以及控制養殖水體富營養化提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養

實驗用普通小球藻（Chlorella vulga）、魚腥藻（Anabaenasp.strain PCC）購自中國科學院水生生物研究所。藻種擴大培養采用BG11培養基。實驗中使用的玻璃儀器均經清水沖洗后，在質量濃度為1%的稀鹽酸中浸泡30 min，再用無菌水沖洗，高溫滅菌，烘干備用。試驗期間的培養條件與擴大培養期間的培養時的條件一致，光照強度約為 2.5×103lx，光暗比12 h︰12 h，溫度為25 ℃。光照期間，每隔2 h手工搖勻錐形瓶1次，暗期則靜置。

1.2 試驗設置

本研究設置4個pH梯度，分別為6，7，8和9。每個pH均設置3個試驗組，分別為普通小球藻單獨培養組（簡稱C組）、魚腥藻單獨培養組（簡稱A組）、普通小球藻和魚腥藻共同培養組（簡稱CA組）。每組試驗設置3個平行。

實驗時，將達到接種濃度的普通小球藻、魚腥藻在5000 r·min-1轉速下離心8 min，去掉上清液，用BG11培養基稀釋到實驗所需濃度。各組普通小球藻、魚腥藻的初始接種密度均設置為 5×105cell·mL-1。在容積為250 mL錐形瓶中加入對應pH的BG11培養液200 mL，然后置于智能光照培養箱（沃信儀器，無錫）內，在不同pH條件下進行一次性培養（中間不更換培養液），每24 h用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH對pH進行調節。

1.3 細胞計數

自實驗開始后每24 h計數藻類數量。計數方法參照《水和廢水監測分析方法（第四版）》。當所有藻類生物量均出現負增長時，試驗結束，藻類出現負增長前 1 d的生物量即為該種藻類的最大現存量。

1.4 數據整理

1.4.1 比生長速率

根據藻液細胞密度計算比生長速率。比生長速率的計算方法為（Chu等，2007；孟順龍等，2012）：

式中：μn為第n天的比生長速率；Nn為第n天的細胞密度（cells·L-1）；Nn-1為第n-1天的細胞密度（cells·L-1）；tn為對應于Nn的培養天數；tn-1為對應于Nn-1的培養天數。同時，將藻類從試驗開始至生物量達最大現存量這一時間段內的比生長速率的平均值定義為藻類的平均比生長速率（μ），用于比較藻類生長速率的大小。

1.4.2 生長曲線擬合

以邏輯斯諦方程擬合藻類的增長過程。首先進行參數估計，每個處理組的最大生物量（Nmax）作為各自的K估計值。應用邏輯斯諦方程的對數形式（式 2），以最小二乘法進行回歸分析，獲得該方程的斜率和截距作為a和r的估計值。

式中：N為藻類生物量；K為最大生物量；r為內稟增長率；t為培養時間。

1.4.3 競爭抑制參數的計算

利用Lotka-Volterra競爭模型的差分形式（式3、式4）計算競爭抑制參數（孟順龍等，2012）。

式中：Nc和Na分別為共同培養中的普通小球藻和魚腥藻在時間tn時的數量（×104cells·mL-1）；Ncn-1和Nan-1分別為共同培養中普通小球藻和魚腥藻在時間tn-1時的數量（×104cells·mL-1）；rc和ra分別為普通小球藻和魚腥藻的內稟增長率（由單種培養經回歸計算獲得）；Kc和Ka分別為普通小球藻和魚腥藻的最大環境容量（由單種培養獲得）；α和β分別為共同培養中魚腥藻對普通小球藻和普通小球藻對魚腥藻的競爭抑制參數。

應用上述公式計算共同培養藻類的增長曲線在拐點以后至達到最大環境容量時間段內每一單位時間的所有競爭抑制參數，取其平均值作為該種藻類對另一種藻類的競爭抑制參數估計值。

參照Logistic方程，藻類的增長有一個從正加速到負加速的過程，即在增長曲線的拐點之后，藻類的增長過程減緩并逐漸趨于穩定在一個水平上。生物生長拐點的生物學意義是生物個體從自由的快速增長階段轉入相互抑制的生長階段，也即密度制約的起始點（setting point）或抑制起始點（陳德輝等，1999）。因此，藻類增長曲線的拐點就是抑制起始點，即邏輯斯諦方程二階導數等于零的時間tp值，這時N=K/2，tp=α/r（茅華等，2008），tp對α/r取整數（陳德輝等，1999）。

1.5 統計分析

采用單因素方差分析對數據進行統計處理，并用t檢驗方法對回歸方程進行回歸顯著性檢驗；P<0.05時，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同pH下普通小球藻和魚腥藻的生長情況

不同pH下，普通小球藻、魚腥藻的生長情況如圖1所示。方差分析表明，無論是在單種培養還是在共同培養體系中，pH對兩種藻類的最大生物量均產生顯著影響。單種培養體系中，普通小球藻和魚腥藻的最大生物量隨著pH的增加而增加，pH 9時的最大生物量顯著高于其他組（p<0.05）。在相同培養時間下，普通小球藻的生物量基本表現為pH9>pH8>pH7>pH6；魚腥藻的生物量均表現為pH9>pH8>pH7>pH6。共同培養體系中，普通小球藻的最大生物量表現為 pH9>pH8>pH6>pH7，且 4種pH間最大生物量差異顯著（p<0.05），在相同培養時間下，普通小球藻的生物量在1～8 d中基本表現的為：pH9>pH7>pH8>pH6。共同培養體系中，魚腥藻的最大生物量隨pH的升高而增加，且4種pH間最大生物量差異顯著（p<0.05），同時，在相同培養時間下的魚腥藻生物量也基本表現為pH9>pH8>pH7>pH6，這與單種培養體系相同。

由表1可見，pH能夠對兩種藻的平均比生長速率產生影響。無論在單種培養還是共同培養下，魚腥藻的平均比生長速率均表現為：pH9>pH8>pH7>pH6；而普通小球藻的平均比生長速率在單種培養條件下表現為：pH9>pH7>pH8>pH6，在共同培養條件下表現為：pH9> pH8>pH6>pH7。單種培養體系中，普通小球藻和魚腥藻在不同pH下的生長曲線基本符合S型生長曲線（圖1），說明不同pH下，單種培養藻類的生長曲線均可用Logistic模型擬合，并可以根據Logistic方程計算拐點出現時間（表2）。同時，為計算拐點出現時間，共同培養體系中的普通小球藻、魚腥藻的生長也用Logistic方程進行了擬合，并由此得到各生長曲線的拐點出現時間（表2）。

圖1 不同pH普通小球藻和魚腥藻單種培養組及共同培養組的生長曲線Fig. 1 Growth curves of Chlorella vulga and Anabaenasp.strain PCC in pure culture and mixed culture system s at different pH

表1 不同pH下普通小球藻和魚腥藻的平均比生長速率Table 1 Mean μ of Chlorella vulga and Anabaenasp.strain PCC at different pH (μ)

2.2 普通小球藻和魚腥藻兩兩間競爭抑制參數

以單種培養體系中擬合得到的K、r值和共同培養體系中普通小球藻和魚腥藻的細胞數帶入式（3）、（4），計算共同培養體系中普通小球藻對魚腥藻以及魚腥藻對普通小球藻競爭抑制參數（表3）。

如表3所示，在4個pH條件下普通小球藻對魚腥藻的競爭抑制參數（β）均大于魚腥藻對普通小球藻的競爭抑制參數（α）。pH7.0時普通小球藻對魚腥藻的競爭抑制參數（β）最大；魚腥藻對普通小球藻的競爭抑制參數（α）則是pH6.0時最大。同時，由表2可見，單種培養體系中，4個 pH條件下，魚腥藻出現拐點的時間都比普通小球藻晚；在共同培養體系中，在pH6.0、7.0、9.0時，普通小球藻的拐點出現時間均早于魚腥藻，而在pH8.0時，普通小球藻和魚腥藻出現拐點的時間基本一致。

表2 不同pH下普通小球藻和魚腥藻的邏輯斯諦模型擬合參數及拐點出現的時間Table 2 Parameters of Chlorella vulga and Anabaenasp.strain PCC regression coefficients of Logistic model and the inflection points at different pH

表3 不同pH下普通小球藻和魚腥藻的競爭抑制參數Table 3 Inhibition parameters of Chlorella vulga and Anabaenasp.strain PCC after inflection point at different pH

3 討論

3.1 pH對單種培養體系中普通小球藻和魚腥藻生長的影響

水體pH主要從兩方面對微藻產生影響，一方面改變環境酸堿度，酸性太強（H+濃度高）或堿性太強（OH-濃度高）都會對藻細胞產生傷害，只有在適宜的酸堿度范圍內，藻細胞才能正常生長繁殖；另一方面影響碳酸鹽平衡系統及不同形態無機碳分配關系來影響藻類的生長（王菁等，2013）。目前實驗條件下還沒有辦法區分藻類對pH的反應究竟是由于受到酸堿傷害還是由于改變了碳酸鹽平衡系統。本實驗中，魚腥藻和普通小球藻在pH6時生長均受到抑制，應該是受到酸害的作用。大部分藻類對pH的耐受范圍較窄，賀春花等（2011）實驗結果顯示：顫藻在pH7.3～8.6的偏堿性條件下生長良好；茅華等（2007）實驗結果顯示旋鏈角毛藻的最適pH為8.3；許海等（2009）研究了水華魚腥藻在pH6、7、8、9、10對3種淡水藍藻和3種淡水綠藻生長的生長情況，結果表明，水華魚腥藻最適生長pH在8.0～9.0，綠球藻為7.0～8.0；歐陽崢嶸等（2010）研究表明，小球藻適宜在中性偏堿的條件下生長，在pH6.0中，凈光合放氧速率下降為零。從本文的研究結果看，普通小球藻和魚腥藻的最大生長量隨著pH的增大而增加，本試驗中其最適生長的pH均為9.0。

3.2 pH對普通小球藻和魚腥藻生長競爭的影響

薛凌展（2010）的研究表明銅綠微囊藻pH在8～11范圍內生長良好，其最佳生長pH值為9，而普通小球藻則pH在7～9之間生長較好，其最佳pH值為 8。共同培養的試驗結果顯示堿性環境中銅綠微囊藻的競爭優勢強于普通小球藻，pH為8～10時β值大于α值，而pH為7時普通小球藻占優勢，α值大于β值。從本研究結果看，試驗pH下，共同培養中普通小球藻和魚腥藻的生長量都遠小于單種培養中的生長量（P<0.05）；pH7.0時普通小球藻對魚腥藻的競爭抑制參數最大，分別為pH6.0、7.0、9.0下的1.27倍、1.42倍、4.33倍；魚腥藻對普通小球藻的競爭抑制參數（α）則是pH 6.0時最大，分別是 pH 7.0、pH 8.0、pH 9.0時的 1.05、2.64、6.20倍。這種現象說明，pH對藻類的競爭抑制參數能夠產生較大影響，且魚腥藻對普通小球藻的競爭能力在pH6.0時環境下最強，而普通小球藻對魚腥藻的競爭能力則在pH7.0時最強。

從共同培養體系中普通小球藻和魚腥藻的拐點出現時間看，在pH 6.0、7.0、9.0時，普通小球藻的拐點出現時間均早于魚腥藻，而在pH 8.0時，普通小球藻和魚腥藻的拐點都出現第7天。生物生長拐點的生物學意義是生物個體從自由的快速增長階段轉入互相抑制的生長階段，也即抑制的起始點（陳德輝,等,1999）。上述現象說明，在pH 6.0、7.0、9.0時，普通小球藻的生長首先被抑制；而在pH 8.0時，普通小球藻和魚腥藻幾乎同時對對方產生抑制。

藻類種間抑制主要是通過競爭光照、營養鹽等資源而產生的抑制以及分泌克生物質而產生的抑制（鄭朔方等, 2005）。從本試驗中魚腥藻和普通小球藻的競爭抑制參數研究結果看（表3），在4個pH條件下，雖然魚腥藻對普通小球藻的抑制作用先于普通小球藻對魚腥藻的抑制作用，但魚腥藻對普通小球藻的競爭抑制參數（α）均小于普通小球藻對魚腥藻的競爭抑制參數（β）；說明在試驗 pH下，魚腥藻對普通小球藻的抑制能力均小于普通小球藻對魚腥藻的抑制能力，說明普通小球藻在競爭中占優勢。這種現象可能是因為普通小球藻分泌出的某種抑制物質的作用強于魚腥藻分泌出的抑制物質。

4 結論

在試驗所設pH條件下，無論在單種培養體系還是共同培養體系中，魚腥藻的最大現存量都隨著pH的升高而增加，說明堿性條件對魚腥藻生長有利，同時也表明魚腥藻是一種耐堿性藻類。單種培養條件下，普通小球藻的最大現存量隨pH升高而增加；共同培養條件下，最大現存量隨pH的變化表現為pH9>pH8>pH6>pH7。

pH對藻類的競爭抑制參數能夠產生顯著影響，pH 6.0時，魚腥藻對普通小球藻的競爭抑制參數最大；而普通小球藻對魚腥藻的競爭抑制參數則是在pH 7.0時最大。在4個pH條件下，魚腥藻對普通小球藻的競爭抑制參數（α）均小于普通小球藻對魚腥藻的競爭抑制參數（β）；說明抑制作用與環境中藻種的相對藻量有關，在試驗pH下，魚腥藻對普通小球藻的抑制能力均小于普通小球藻對魚腥藻的抑制能力，普通小球藻在競爭中處于優勢。

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