不同直徑卵泡對綿羊卵母細胞體外發育能力的影響

張利等

摘要：以屠宰場綿羊卵巢為材料，采用抽吸法收集小卵泡、中卵泡、大卵泡卵母細胞，研究不同卵泡直徑對卵母細胞回收效果、比例分布以及對卵母細胞直徑、谷胱甘肽（GSH）含量和體外發育能力的影響。結果表明，3種卵泡卵母細胞比例分布差異極顯著（P<0.01）；3種卵泡卵母細胞的回收率無顯著差異（P>0.05），但中、大卵泡卵母細胞可用率極顯著高于小卵泡卵母細胞（P<0.01）；小卵泡卵母細胞的直徑極顯著小于中、大卵泡卵母細胞（P<0.01）；中、大卵泡卵母細胞成熟培養24 h后GSH含量顯著高于小卵泡卵母細胞（P<0.05）；經孤雌激活體外培養后，中、大卵泡卵母細胞的成熟率分別極顯著（P<0.01）、顯著（P<0.05）高于小卵泡卵母細胞，中、大卵泡卵母細胞囊胚率極顯著高于小卵泡卵母細胞（P<001）；中卵泡卵母細胞囊胚細胞總數顯著高于小卵泡卵母細胞（P<0.05），但與大卵泡卵母細胞差異不顯著（P>005）。因此，直徑≥2 mm的卵泡的卵母細胞適合體外培養和體外胚胎的生產。

關鍵詞：卵泡直徑；綿羊；卵母細胞；孤雌激活

中圖分類號： S826.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0141-04

隨著哺乳動物體外受精、克隆、轉基因等生物技術研究的不斷深入，對動物卵母細胞的數量、質量要求越來越高。目前，胚胎體外生產（in vitro production，IVP）的卵母細胞主要來源于屠宰場收集的卵巢，由于屠宰動物的年齡及卵巢表面卵泡的大小等存在差異，培養后獲得的胚胎質量也有很大差異[1]，一般收集的卵泡卵母細胞囊胚率都很低[2]。與體內自然成熟的卵母細胞相比，體外培養的卵母細胞成熟率、受精率和早期胚胎發育能力呈現不同程度的下降趨勢。在體內，卵母細胞在卵泡內發育成熟，作為卵母細胞的生長環境，卵泡的大小對卵母細胞的成熟和后期發育潛力起著至關重要的作用[3]。Crozet等早期報道，不同直徑卵泡中的卵母細胞發育能力不同，所以研究卵泡大小對后期發育潛力的影響十分必要[4]。目前，國內外很多研究者只報道了山羊[5-6]、牛[3]的卵泡大小對卵母細胞發育的影響，且國內還未見對綿羊的報道。本研究分析卵泡直徑對卵母細胞的回收效果、比例分布以及對卵母細胞直徑、谷胱甘肽（GSH）含量和體外發育能力的影響，以期為胚胎工程中卵子的來源和選擇提供基礎依據，并提高體外生產胚胎的水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及試劑 本研究所用化學試劑除特殊說明外均購自Sigma公司；培養用胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸（NEAA）購自Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA）購自Bovogen公司。

1.1.2 卵巢采集 卵巢采集于新疆維吾爾自治區烏魯木齊市華凌屠宰場。母羊屠宰后立即剖腹取出卵巢，置于37～38 ℃含青霉素、鏈霉素（雙抗）的生理鹽水中，2～3 h內送至實驗室；用約38.5 ℃、含有雙抗的生理鹽水洗滌2～3次，以滅菌的吸水紙吸干后，用帶9號針頭的吸有1～2 mL抽卵液的10 mL注射器分別抽取<2 mm（小卵泡）、2～5 mm（中卵泡）、>5 mm（大卵泡）的卵泡中的卵泡液；分別在體式鏡下挑選出卵丘細胞包裹3層以上、結構致密的卵母細胞-卵丘細胞復合體（cumulus oocyte complexes，COCs），移入抽卵液中洗3次。

1.2 方法

1.2.1 卵母細胞的體外成熟培養 將各組卵母細胞分別用抽卵液洗滌3次后，再用體外成熟（in vitro maturation，IVM）液洗滌3次，按20～30枚/滴移入100 μL提前5～6 h平衡好的IVM液滴內，在38.6 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下進行成熟培養。液體配制如下：抽卵液：Hepes-199+2%FBS+ 6 U/mL 肝素鈉+100 U/mL雙抗；IVM：TCM199+0.05 U/mL FSH+10%FBS+1 μg/mL雌激素+10 ng/mL EGF+0.1 mmol/L半胱胺酸+24.2 mg/mL丙酮酸鈉+100 U/mL雙抗。

1.2.2 去除卵丘細胞 卵母細胞成熟培養22～24 h后，將卵母細胞在含0.1%透明質酸酶的Hepes-199中用吸管反復吹打去除全部卵丘細胞，在體視鏡下挑出排出第一極體的卵母細胞用于后期培養，并統計體外培養成熟率。

1.2.3 卵母細胞孤雌激活 挑選出有極體且細胞質均勻的卵母細胞在含5 μmol/L離子霉素（ionomycin）的激活液中激活4 min，經2 mmol/L 6-DMAP培養液洗2次后，移入含 6-DMAP 的培養液內培養2 h，培養液洗滌3次后移入含有 600～700 μL 體外培養液的四孔培養板中培養，CO2箱培養條件為38.6 ℃、5%CO2、5%O2、90% N2及飽和濕度，培養 48 h 后統計卵裂率，培養6～8 d統計囊胚率。

1.2.4 囊胚Hoechst細胞染色 取7 d的囊胚，將囊胚轉移到含10 μg/mL Hoechst33342的抽卵液內避光孵育7～10 min，再將囊胚轉移到載玻片上，盡量少帶液體，蓋上蓋玻片，用凡士林封片，在倒置顯微鏡的紫外光下進行細胞計數。

1.2.5 數據統計 數據采用SPSS 13.0統計軟件的 One-way ANOVA方法進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同卵泡直徑的比例

隨機從一批卵巢中抽取約40個卵巢進行樣本統計，分成3種卵泡，卵泡直徑<2 mm（小卵泡）、2～5 mm（中卵泡）、>5 mm（大卵泡）3組間差異極顯著（P<0.01）（表1）。

2.3 不同直徑卵泡中卵母細胞直徑的比較

抽取不同直徑卵泡的卵母細胞，培養24 h后分別脫卵丘后使用尼康（NIS-Element D3.1）系統軟件進行直徑測定，結果如圖1所示，中卵泡和大卵泡卵母細胞的直徑差異不顯著（P>0.05），但均極顯著高于小卵泡卵母細胞的直徑（P<001）。endprint

2.4 不同直徑卵泡中卵母細胞GSH含量的比較

抽取不同直徑卵泡的卵母細胞，培養24 h后分別脫卵丘后進行GSH含量測定（采用江蘇碧云天公司生產的GSH和GSSG檢測試劑盒），結果如圖2所示，隨著卵泡直徑增大，GSH含量增加，中卵泡和大卵泡卵母細胞的GSH含量差異不顯著（P>0.05），但均顯著高于小卵泡卵母細胞的GSH含量（P<0.05）。

2.5 卵泡直徑對卵母細胞體外培養的影響

為了比較卵泡直徑對卵母細胞體外培養效果的影響，將回收的3組卵泡卵母細胞分別成熟培養并孤雌激活，結果如表3所示，小卵泡卵母細胞的成熟率極顯著低于中卵泡卵母細胞（P<0.01），也顯著低于大卵泡卵母細胞（P<0.05）；3組卵泡卵母細胞卵裂率差異不顯著（P>0.05）；小卵泡卵母細胞囊胚率極顯著低于中卵泡和大卵泡（P<0.01），后兩者之間差異不顯著（P>0.05）；中卵泡卵母細胞囊胚細胞總數顯著高于小卵泡（P<0.05），與大卵泡差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

3.1 卵泡直徑對卵泡比例分布的影響

同一卵巢上的卵泡比例分布還未曾有人報道。綿羊是常見的季節性發情動物，其最主要的發情時間集中在9—12月。由于受日照時間和體內激素水平的影響，在非繁殖季節和繁殖季節，卵巢表面的卵泡大小有所不同。非繁殖季節主要為中、小卵泡，中、大卵泡通常在每個卵巢上最多只有2個[7]。本研究結果表明，同一卵巢表面小卵泡（小于2 mm）占的比例較多，隨著卵泡直徑增大，中卵泡（2～5 mm）和大卵泡（大于5 mm）占的比例越來越少，小卵泡、中卵泡和大卵泡3組間差異極顯著，這可能是因為本試驗是在非繁殖季節所統計。

3.2 不同卵泡直徑對卵母細胞回收效果的影響

田長永等報道，山羊不同直徑卵泡卵母細胞的回收率無差異，但在可用率方面，大卵泡卵母細胞極顯著高于小卵泡[6]，本研究結果與該結論一致。隨著卵泡直徑的增大和體內激素的變化，卵泡腔變大，卵泡液增多，顆粒細胞將卵母細胞包裹得更加緊密[8]。本研究中，隨著卵泡增大，回收率和可用率都在增加，僅個別的卵母細胞有退化現象，這與Heighington等的研究結果[9]基本一致，大卵泡的回收率和利用率達到最高，同時也發現小卵泡卵母細胞極易抽成裸卵。究其原因，一是小卵泡的卵泡液較少，卵丘卵母復合體（COCs）和周圍的卵巢組織聯系比較緊密，大部分顆粒細胞和卵泡相連，在抽吸的過程中易于抽裸，而大卵泡卵泡液較多，僅有一小部分顆粒細胞和卵泡相連，卵母細胞接近游離狀態，易于回收；二是大卵泡的卵泡液較多，在抽吸的過程可能會起到一定緩沖作用，減少了針頭對COCs的機械損傷，而小卵泡卵泡液較少，損傷程度可能較大，所以大卵泡和中卵泡的可用率明顯高于小卵泡。這說明卵泡直徑顯著影響卵母細胞的回收利用效果。

3.3 不同直徑卵泡內卵母細胞直徑、GSH含量與卵母細胞成熟的關系

有許多研究者認為，卵母細胞的直徑大小也是其成熟的指標之一。Anguita等報道，卵母細胞直徑比卵泡直徑更能反應其成熟和發育能力[10]。Izumi等報道，貓體內卵母細胞與卵泡同步發育[11]。在早期，Crozet等報道，卵母細胞只有達到一定直徑（家畜約110 μm）后才獲得完成減數分裂發育到MⅡ期的能力[4]，牛直徑110 μm、豬直徑l15 μm 的卵母細胞可以完成減數分裂發育至核成熟[12]。本研究結果表明，培養24 h后，隨著卵泡的增大，卵母細胞直徑有所增加，中卵泡卵母細胞的直徑（115.5 μm）比大卵泡卵母細胞的直徑（115.1 μm）長約0.4 μm，但都極顯著大于小卵泡卵母細胞的直徑（111.8 μm），與早期報道的牛的卵母細胞直徑長度[12]基本一致。在成熟率上，小卵泡卵母細胞極顯著低于中卵泡卵母細胞，并顯著低于大卵泡卵母細胞，小卵泡卵母細胞直徑和成熟率都低于中卵泡和大卵泡，可見卵母細胞直徑的大小可以間接反映其成熟情況。此外，也有研究者認為體外成熟后卵母細胞內GSH含量也可作為卵母細胞胞質成熟的標志[13]。Abdoon等研究表明，培養后排第二極體卵母細胞的GSH含量明顯高于未成熟的卵母細胞[14]。本研究結果表明，小卵泡卵母細胞內GSH含量顯著低于中卵泡和大卵泡，結合上文提到的各組間卵母細胞的成熟率，說明卵泡卵母細胞內GSH含量也是其成熟的重要指標之一。

3.4 卵泡直徑對卵母細胞體外培養效果的影響

在體內，隨著卵泡直徑增大，RNA逐漸在卵母細胞內蓄積，只有在較大的卵泡（≥2 mm）中卵母細胞才能儲存足夠量的RNA，以維持隨后的體外受精和發育。小于2 mm卵泡內的COCs因周圍環境中缺乏某些因子而限制了后期的發育[15]。早期Crozet等對山羊的研究結果顯示，直徑小于 3 mm 卵泡卵母細胞能完成體外成熟和體外受精，但受精卵一般只能發育到8細胞期或16細胞期，而大卵泡卵母細胞受精卵基本都能發育到桑葚胚或囊胚[4]。本研究結果表明，在成熟率上，小卵泡卵母細胞極顯著低于中卵泡卵母細胞，并顯著低于大卵泡卵母細胞，與Feng等的研究結果[15]類似。同時，本研究發現小卵泡卵母細胞在體外成熟培養時，死亡現象明顯多于中、大卵泡卵母細胞，可能是因為小卵泡卵母細胞體內的RNA或其他物質合成儲存不足，不適宜培養，而直徑較大卵泡卵母細胞在體內已趨于易于成熟的階段；但是并沒有出現像Pavlok等提出的過度成熟而導致的老化現象[16]。在卵裂率上，隨著卵泡直徑增大，卵裂率增加，但各組間無顯著差異，這與Crozet等的結果[4]不符，可能是因為本試驗做的是孤雌激活，沒有做體外受精，還有可能是由山羊與綿羊之間的物種差異造成的。在囊胚率上，隨著卵泡直徑增大，囊胚率升高，中、大卵泡卵母細胞之間差異不顯著，但都極顯著高于小卵泡卵母細胞，即小卵泡卵母細胞基本獲得了核成熟能力（排第二極體），能夠完成受精和卵裂；但只有中、大卵泡卵母細胞才能進一步支持受精卵發育到囊胚，這與Han等[17]、Crozet等[4]的研究結果類似。此外，很多研究者在做卵泡直徑對卵母細胞體外培養的影響研究時，基本都只是培養到囊胚階段，而在本研究中又繼續對囊胚Hoechst細胞染色。早期Brison等研究表明，囊胚細胞數是評價胚胎發育質量的一個重要指標，內細胞數越多越易于附植和妊娠[18]。本研究結果顯示，中卵泡卵母細胞的囊胚細胞總數顯著高于小卵泡組，但與大卵泡組差異不顯著。本研究結果比牛[19]、小鼠[20]未分卵泡直徑但利用BCB篩選、體外受精的對照組囊胚總細胞數高，主要原因可能是孤雌激活的囊胚細胞總數本身就比體外受精的高（本實驗室得到孤雌激活的囊胚細胞總數比體外受精的高），也有可能是不同物種的差異造成，具體原因還需繼續研究。可見卵泡直徑對卵母細胞體外培養效果有顯著影響，中、大卵泡的卵母細胞有更大的體外發育潛力。endprint

4 結論

綜上所述，本研究認為，同一卵巢的表面可回收利用的卵母細胞數量有限，卵巢表面卵泡直徑≥2 mm的卵母細胞可以作為卵子的主要來源，并且能夠生產大量的體外胚胎，為胚胎工程提供重要依據；但<2 mm卵泡卵母細胞的利用價值不高的原因還需進一步從分子的角度繼續深入研究。

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