生長曲線法檢測復方大果木姜子軟膠囊的抗腫瘤作用

胡萬福 楊燕

生長曲線法檢測復方大果木姜子軟膠囊的抗腫瘤作用

胡萬福 楊燕

目的 研究復方大果木姜子軟膠囊對腫瘤細胞Hep-2的拮抗作用。 方法 臺盼藍染色法及生長曲線法。結果 通過觀察藥物作用于細胞后對其正常生長曲線的影響, 發現藥物作用于 Hep-2細胞后, 明顯延長細胞正常生長的倍增時(TD2=3.245)從而抑制Hep-2的正常生長。 結論 復方大果木姜子軟膠囊對腫瘤細胞Hep-2的生長具有明顯的抑制作用。

復方大果木姜子軟膠囊；臺盼藍染色；生長曲線；抗腫瘤作用

通常認為細胞膜喪失完整性, 細胞即可被認為已經死亡。臺盼藍(Trypan Blue)是檢測細胞膜完整性最常用的生物染色試劑。正常細胞能夠排斥臺盼藍, 而死亡的細胞由于細胞膜的完整性喪失, 通透性增加, 細胞可被臺盼藍染成藍色［1］。依據此原理, 細胞經臺盼藍染色后, 可通過顯微鏡,直接鏡下計數或拍照后計數, 實現對細胞存活率比較精確的定量分析。基于這一原理, 本文通過此方法證明復方大果木姜子軟膠囊對腫瘤細胞Hep-2的生長具有明顯的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞培養 Hep-2 細胞(貴陽醫學院組織工程與干細胞中心提供)、在5%CO2, 37℃的細胞培養箱內培養, 用含10%新生牛血清、青霉素(100 μg/ml), 鏈霉素(100 μg/ml)的RMPI1640培養液傳代培養, 實驗用細胞選擇處于對數生長期的細胞。

1.1.2主要藥品與試劑 復方大果木姜子軟膠囊(貴陽中醫學院制劑教研室提供)、喜樹堿(武漢李時珍藥業有限公司,批號：20120401)RPMI-1640培養基(Gibco公司產品)、新生牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)、DMSO為Sigma公司產品, 其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1實驗用復方大果木姜子內容物的處理及給藥濃度的確定 在保證用藥劑量的前提下, 將藥物制備為固體分散體,從而方便藥物與細胞充分作用, 制備前后測定主要藥物含量達到67.8%。臨用前, 用含2%新生牛血清RMPI1640培養基稀釋藥物, 起始給藥濃度為100 μg/ml；采用臺盼藍染色方法, 首先以100、10、1 μg/ml三個濃度進行藥物初篩［2］, 根據初期實驗結果, 確定以10 μg/ml為主進行藥物作用后活細胞率(EC50, EC50=未染色細胞數/細胞總數×100%)值測定。設復方組、陽性組與空白組, 給藥濃度(單位μg/ml)依次為16、8、4、2、1, 可以求得Hep-2作用于各組的EC50值分別為復方組7.382 μg/ml；對照組3.89 μg/ml。各給藥濃度下細胞計數結果見表1。

表1 不同濃度下(單位μg/ml)細胞計數結果(n×104)及活細胞率(%)

1.2.2實驗用細胞株的培養 根據Hep-2細胞株的生長特性, 取其復蘇, 在37℃、5%CO2的培養箱內(飽和濕環境)培養, 培養基為含10%新生牛血清的RPMI1640培養基, 換液采取全換液方式進行, 洗液為Hank’s液待細胞長滿后傳代。

1.2.3實驗過程 取處于對數生長期的Hep-2, 用含10%新生牛血清的RPMI1640培養基配制為1×104/ml的細胞懸液, 在25 ml培養瓶中接種5 ml, 共接種21瓶, 分為正常組、藥物組與陽性對照組(每組7瓶), 分別加入終濃度為EC50的受試藥物與對照藥物, 在給藥2 h, 1、2、3、4、5、7 d時分別取樣40 μl(取樣時先用2.5%的胰蛋白酶將貼壁細胞充分消化), 加入0.4%的臺盼藍試劑10 μl染色后, 在顯微鏡下進行細胞計數, 以每天細胞計數結果的對數為縱軸, 以時間為橫軸繪制細胞生長曲線, 對比觀察藥物對各實驗細胞的生長抑制作用, 結果見表2及繪制的各實驗組在不同實驗條件下的細胞生長抑制曲線圖, 見圖1。

表2 藥物作用于腫瘤細胞Hep-2后的不同時間細胞計數結果(n×104)

圖1 藥物對Hep-2細胞的生長抑制曲線

1.3統計學方法 采用SPSS11.5統計學軟件處理數據。各實驗組間比較和不同濃度條件下比較均采用齊性方差t檢驗, P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 實驗結果及分析

依據藥物作用于細胞倍增時(TD)公式：TD=0.301 t/(logNtlogNo)(t：培養時間, No：首次記下的細胞數, Nt：t時間后的細胞數)可以求得：空白組TD1=1.081；藥物組TD2=3.245；對照組TD3=2.361。

通過上述數據分析可知：與空白組細胞正常倍增時(TD1=1.081)比較, 復方組作用于Hep-2細胞后可以明顯的延長細胞的倍增時(TD2=3.245), 且作用強于對照組(TD3=2.361)；同時, 結果表明, 復方對Hep-2細胞的抑制作用是通過影響Hep-2細胞的正常生長周期而發揮作用。

藥物對Hep-2細胞生長飽和密度的影響(NS)：從細胞生長抑制圖中可以看出, 藥物作用于Hep-2細胞后, 明顯影響其正常生長, 細胞生長飽和密度顯著降低, 與正常組細胞比較, 細胞生長達大坪期的時間與細胞數目顯著降低, 但作用與喜樹堿相比略差。

3 討論

腫瘤已逐漸成為人類重大殺手之一。而中藥復方抗腫瘤研究則是開發抗癌中藥制劑研究的一個重要領域。但是如何在眾多的單味中藥中尋找出有效的抗癌藥物呢？因此對中藥抗腫瘤的篩選是其中的研究重點［3-5］。本研究立足于單味中藥已有的現代藥理研究成果, 結合傳統中藥復方配伍理論,深入挖掘民族醫藥精髓, 對研制開發的復方大果木姜子軟膠囊進行抗腫瘤細胞研究。這些實驗研究, 為進一步中藥復方的體外抗腫瘤研究提供了實驗依據。

本研究以Hep-2細胞株為篩選模型, 采用體外抑制腫瘤增殖的方法, 對復方大果木姜子軟膠囊的藥物有效部位采用臺盼藍染色法結合細胞生長曲線繪制從而直觀的表明實驗藥物對Hep-2的生長抑制作用。

綜上所述, 復方大果木姜子軟膠囊對腫瘤細胞Hep-2的正常生長增殖具有明顯的抑制作用, 進一步為該復方制劑的開發提供理論依據。同時結合實驗用藥物提取部位可知：脂溶性成分是其抗腫瘤作用的主要部位, 但對其中的抗腫瘤活性具體成分有待進一步研究。

［1］ 張卓然.實用細胞培養技術.北京：人民衛生出版社, 1999: 198.

［2］ 黃禎祥.醫學病毒學基礎及實驗技術.北京：科學出版社, 1990:661~693.

［3］ 吳劍, 滕國英.中藥誘導腫瘤細胞凋亡的研究進展 .國際醫藥衛生導報, 2007, 13(8):114-117.

［4］ 林建軍, 曾金雄, 戴西湖.抗肝癌中藥的生物學效應研究進展.中醫藥通報, 2005, 4(6):62.

［5］ 張艷瓊, 黃利鳴, 吳江峰, 等.天花粉蛋白對荷瘤小鼠抑瘤作用的實驗研究.時珍國醫國藥, 2009, 20(10):2389-2390.

Anti-tumor effect of compound fructus litsea pungens soft capsule tested by growth curve method

HU Wan-fu, YANG Yan.
First Affiliated Hospital of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China

ObjectiveTo study the antagonism of compound fructus litsea pungens soft capsule on tumour cell Hep-2.MethodsTrypan blue and growth curve methods were applied.ResultsObservation of the influence of the drug on the normal growth curve of cell showed that the drug inhibited growth of cells by prolonging the normal growth multiplication (TD2=3.245).ConclusionCompound fructus litsea pungens soft capsule has obvious inhibiting effect on tumour cell Hep-2.

Compound fructus litsea pungens soft capsule; Trypan blue; Growth curve ; Antitumor effect

2014-05-13］

550002 貴陽中醫學院第一附屬醫院(胡萬福)；貴陽醫學院組織工程與干細胞中心(楊燕)