高效液相色譜-熒光檢測法測定人血漿中洛美沙星的濃度

王世霞 朱余兵

高效液相色譜-熒光檢測法測定人血漿中洛美沙星的濃度

王世霞 朱余兵

目的建立用高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLU)測定人血漿中洛美沙星的濃度。方法血漿樣品經甲醇沉淀后, 以甲醇-磷酸二氫鉀緩沖液(pH：2.8, 35：65, v/v)為流動相, 流速為1.0 ml/min, 色譜柱為BaiAn-C18(4.6×150 mm, 5 μm), 柱溫為25℃, 熒光檢測波長λex=280 nm, λem =455 nm。結果血漿內源性雜質不干擾待測物測定, 洛美沙星在0.10~10.04 μg/ml有良好線性關系(r=0.9995), 定量下限為0.10 μg/ml, 日內、日間精密度(RSD)均小于10 %, 樣品穩定性良好。結論該法靈敏、快速、簡便, 適合用于洛美沙星的藥動學研究。

洛美沙星；血藥濃度；高效液相色譜-熒光檢測法

洛美沙星(lomefloxacin, LM)是喹諾酮類第三代二氟喹諾酮類抗菌藥, 作用于細菌的DNA回旋酶, 使DNA不能形成超螺旋, 造成染色體的不可逆損害, 而使細菌細胞不再分裂。臨床應用廣泛, 用于泌尿系統感染、性病的治療、外科感染、呼吸道感染、風濕病并發感染及眼科感染性疾病的治療等［1］。目前, 文獻［2, 3］報道中可以測定人體膽汁、尿液、血漿中洛美沙星的含量, 作者在文獻［3-5］的基礎上, 建立了用HPLC法測定血漿中洛美沙星濃度的方法。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 美國Agilent 1100系列高效液相色譜儀(配備二元高壓泵, 在線真空脫氣機, 自動進樣器及其溫控系統, 半微量池可變紫外檢測器和熒光檢測器, Agilent高級化學色譜數據工作站), METTLER電子天平。洛美沙星標準品(批號：0452-200001, 購自中國藥品生物制品檢定所, 含量90.0%)。甲醇(色譜純, TEDIA)；超純水為自制；空白人血漿(南京市中心血站提供)；其他試劑為分析純。

1.2色譜條件 色譜柱：BaiAn-C18, 5 μm, 4.6×150 mm , 流動相： 甲醇：磷酸二氫鉀緩沖液(pH：2.8, 35：65, v/v), 流速：1.0 ml/min , 柱溫：25℃, 熒光檢測器檢測(λex=280 nm, λem=455 nm)。

1.3標準溶液的配置 精密稱取洛美沙星標準品5.57 mg (相當于洛美沙星5.01 mg), 置于10 ml量瓶中, 加入流動相溶解并稀釋至刻度, 搖勻, 即501.00 μg/ml 洛美沙星的儲備液。精密吸取儲備液1 ml置于10 ml量瓶中, 加入流動相稀釋至刻度, 搖勻, 即得 50.10 μg/ml洛美沙星甲醇溶液；依次稀釋,配成5.01 μg/ml洛美沙星標準溶液。

1.4含藥標準血樣的制備 取離心管數支, 分別精密加入不同量的洛美沙星標準液后以氮氣流吹干, 加入空白血漿0.20 ml, 渦旋1 min, 配成血漿中含洛美沙星分別為0, 0.10, 0.20, 0.50, 1.00, 2.01, 5.01, 10.04 μg/ml的標準系列濃度, 同法依次配成血漿中含洛美沙星分別為0.20, 1.00, 8.02 μg/ml的低、中、高質控血樣。

1.5血漿樣品的處理 精密加入含藥血漿樣品0.20 ml于離心管中, 加入0.60 ml甲醇, 渦旋3 min, 于16000 rpm離心3 min。吸取上清液置于自動進樣分析小瓶中, 精密取10 μl進樣分析。

2 方法與結果

2.1專屬性及線性范圍 洛美沙星出峰時間在6.5 min左右,洛美沙星峰形良好, 無干擾, 基線平穩, 見圖1。將系列濃度標準含藥血漿樣品, 按“血漿樣品的處理”項操作, 每種濃度5份樣品, 記錄色譜圖及洛美沙星峰面積。以洛美沙星峰面積f對血藥濃度(c)作回歸計算, 得回歸方程：f=0.0229×c+0.0031, (r=0.9995, 權重系數r=1/c×c), 定量下限濃度為0.10 μg/ml。

圖1 血漿中洛美沙星色譜圖

2.2回收率及精密度 取離心管數支, 分別取洛美沙星標準液適量于離心管中, 用流動相配成濃度分別為0.20, 1.00, 8.02 μg/ml的洛美沙星溶液, 每份0.20 ml, 以氮氣流吹干后,精密加入0.60 ml甲醇溶解殘渣, 精密吸取10 μl進樣分析,記錄色譜圖, 計峰面積As；另取離心管數支, 精密加入適量的洛美沙星溶液, 以氮氣流吹干后, 精密加入0.20 ml空白血漿, 渦旋15 s, 配成含洛美沙星0.20, 1.00, 8.02 μg/ml的含藥血漿, 混勻, 加入0.60 ml甲醇, 渦旋3 min, 于16000 rpm離心3 min, 吸取10 μl上清液進樣分析。記錄色譜圖, 計峰面積Ax, 上述Ax和As的比值即為洛美沙星的絕對回收率。將前述標準曲線質控樣品系列濃度的洛美沙星峰面積代入相應標準曲線方程, 計算測得濃度和加入濃度的比值即為相對回收率, 同法可算出日內、日間RSD, 結果見表1。

表1 血漿中洛美沙星絕對回收率和相對回收率 (%)

表1 血漿中洛美沙星絕對回收率和相對回收率 (%)

加入濃度(μg/ml)絕對回收率RSD相對回收率RSD日內RSD日間RSD 0.2082.8±8.29.8103.4 ±4.64.56.97.2 1.0083.0±5.26.3109.7±4.74.35.25.7 8.0288.3±1.11.4103.0±4.24.15.95.9

2.3穩定性試驗 取干凈離心管數支, 按標準曲線配制方法制備含洛美沙星0.20, 1.00, 8.02 μg/ml的標準含藥血漿, 平行制備5份, 一份配制好后按“血漿樣品的處理”項操作后,立即進樣分析；一份血樣室溫放置4 h后提取操作；一份提取后于4 ℃自動進樣器放置10 h；一份于冰箱中冷凍保存3周后取出化凍；另一份在3周內反復凍融3次, 然后同法操作。各濃度樣本測定值的RSD均<10 %, 結果表明樣品在上述條件下穩定性良好。

3 討論

由于洛美沙星溶液具有光不穩定性, 經反復試驗考察光對洛美沙星溶液的影響, 證實標準液、血漿中洛美沙星見光后都顯著發生分解。故在洛美沙星血樣采集、處理、存放及測定的全過程中, 都應注意避光, 否則將導致測定結果偏低。

目前洛美沙星血藥濃度測定方法多采用HPLC法, 其檢測器包括紫外檢測器、熒光檢測器和二極管陣列檢測器［2-5］。作者采用HPLC-FLU方法測定洛美沙星血藥濃度, 其定量下限為0.10 μg/ml, 可滿足藥動學和藥效學實驗需要。同時考慮樣品穩定性和靈敏度, 確定用甲醇-磷酸二氫鉀緩沖液(pH：2.8, 35：65, v/v)作為流動相, 在此條件下, 洛美沙星峰形良好,無雜質干擾測定, 基線平穩。作者建立的HPLC-FLU方法出峰時間在6.5 min, 相較于既往HPLC方法, 樣品分析時間短,適合大樣本量的測試。同時文獻［6］中采用液液萃取法處理血樣, 內標法測定洛美沙星血藥濃度, 過程較繁瑣, 經優化后采用甲醇沉淀血樣, 外標法測定洛美沙星血藥濃度, 操作簡便、快速、準確度高, 且回收率及精密度結果均較好。

［1］ 董春峽, 胡鳳鑾, 林潔.洛美沙星的藥理作用、臨床應用和不良反應.齊魯藥事, 2004, 23(7):38-39.

［2］ 陳畫虹, 韓麗萍, 張延軍, 等.反相HPLC法測定膽汁中洛美沙星的濃度.廣東藥學院學報, 2002, 18(4):302-304.

［3］ 楊健, 杜繼昭, 王其南, 等.國產洛美沙星膠囊的人體藥物動力學.中國醫院藥學雜志, 2000, 20(3):133-135.

［4］ 郭善斌, 肇麗梅, 邱楓, 等.鹽酸洛美沙星分散片及膠囊劑的健康人體藥動學.沈陽藥科大學學報, 2003, 20(6):413-415.

［5］ 郎麗萍, 于麗均.反相高效液相色譜法測定人血清中洛美沙星濃度.溫州醫學院學報, 2005, 35(3):240-241.

［6］ 顧繼紅, 高杰.反相高效液相色譜熒光法測定人血漿中左氧氟沙星的濃度.蘇州大學學報(醫學版), 2007, 27(6):952-954.

Measure of concentration of lomefloxacin in human plasma by high performance liquid chromatographyfluorescence assay

WANG Shi-xia, ZHU Yu-bing.Liu’an Yeji District Central Hospital, Liu’an 237431, China

ObjectiveTo apply high performance liquid chromatography-fluorescence assay (HPLCFLU) in measuring concentration of lomefloxacin in human plasma.MethodsPlasma samples were precipitated by methanol.Methanol-monopotassium phosphate buffer solution (pH: 2.8, 35:65, v/v) was applied as mobile phase, and its flow velocity was 1.0 ml/min, chromatographic column was BaiAn-C18(4.6×150 mm, 5 μm), column temperature was 25℃, and Fluorescence detection wavelength was λex=280nm and λem=455nm.ResultsThe intrinsic impurity of plasma did not interfere with the measurement of determinand.Linearity of lomefloxacin was good at 0.10~10.04 μg/ml (r=0.9995), and the lower limit of quantitation was 0.10 μg/ml.The day-to-day and within-day relative standard deviation (RSD) were all less than 10%.ConclusionThis measure method is fast, sensitive, and simple, which can be applied to the pharmacokinetic study of lomefloxacin.

Lomefloxacin; Plasma concentration; High performance liquid chromatography-fluorescence assay

2014-05-28］

237431 安徽省六安市葉集區中心衛生院(王世霞)；南京醫科大學附屬南京醫院藥學部(朱余兵)

朱余兵