雷帕霉素對順鉑作用下人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細胞增殖、侵襲、黏附及自噬凋亡的影響*

金 柱， 高寶安

(三峽大學第一臨床醫學院，宜昌市中心人民醫院呼吸內科，湖北 宜昌 443003)

雷帕霉素對順鉑作用下人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細胞增殖、侵襲、黏附及自噬凋亡的影響*

金 柱， 高寶安△

(三峽大學第一臨床醫學院，宜昌市中心人民醫院呼吸內科，湖北 宜昌 443003)

目的： 研究雷帕霉素(Rap)對順鉑(DDP)作用下人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP 細胞增殖、遷移、黏附及其自噬凋亡的影響。方法: 培養人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細胞株，利用MTT方法分別檢測Rap和DDP單獨與聯合作用對A549及耐藥A549/DDP細胞增殖抑制率的影響；Transwell方法檢測Rap和DDP單獨與聯合作用對A549及耐藥A549/DDP細胞體外侵襲能力的影響；黏附實驗檢測Rap和DDP單獨與聯合作用對A549及耐藥A549/DDP細胞體外侵襲能力的影響；流式細胞術檢測Rap和DDP單獨與聯合作用對A549及耐藥A549/DDP細胞凋亡的影響；Western blotting檢測Rap和DDP單獨與聯合作用對A549及耐藥A549/DDP細胞自噬標志蛋白beclin-1和LC3表達的影響。結果: 與Rap或DDP單獨作用組相比，Rap和DDP聯合作用能夠同時顯著抑制人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細胞增殖、體外侵襲能力及細胞黏附能力，并能夠促進細胞凋亡和自噬標志蛋白beclin-1和LC3的表達(均P<0.05)。結論: Rap能夠通過促進細胞自噬而增強DDP的作用，進而抑制人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細胞的增殖、侵襲、黏附并促進細胞凋亡作用，具有協同作用。

雷帕霉素； 順鉑； 人肺腺癌細胞； 細胞凋亡； 細胞侵襲； 自噬

肺癌是目前世界上發病率和死亡率增長最快的一種惡性腫瘤，在我國發病率和死亡率也一直呈上升趨勢，而其中以非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)為主，占到發病率的85%[1]。非小細胞肺癌患者一般發現較晚，確診時大多已不易采用直接手術治療，臨床上多采用化療作為NSCLC治療的重要手段[2]。NSCLC的化療多以鉑類藥物作為聯合化療的基礎，順鉑(cis-diamminedichloroplatinum，DDP)是目前廣泛使用并較有效的一線化療藥物，其對腫瘤細胞的抑制毒性作用主要通過形成鉑-DNA復合物，但臨床上使用易產生其耐藥性從而制約了療效[3]。肺癌的鉑類耐藥是影響化療療效的重要因素，因此如何解決肺癌的耐藥性對于臨床治療NSCLC具有重要意義，而侵襲、黏附和凋亡等細胞功能作為惡性腫瘤的重要生物學特征，也是臨床NSCLC患者治療復發和死亡的主要原因[4]。雷帕霉素(rapamycin，Rap)是mTOR信號通路的特異性抑制劑，可通過抑制mTOR信號通路活化自噬，從而發揮腫瘤抑制效應[5]。A549/DDP是人肺腺癌系A549經DDP誘導產生的多藥耐藥性NSCLC細胞系，它同時對卡鉑、氨甲喋呤等產生交叉耐藥性[6]。本研究將mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素Rap和DDP單獨或聯合作用，觀察其能否增加DDP對人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細胞的敏感性及對細胞增殖、侵襲、黏附、凋亡的影響，并探討其是否通過促進細胞自噬發揮作用。通過本研究對擺脫肺癌化療耐藥現象，顯著提高化療效果具有重要意義。

材 料 和 方 法

1 細胞株與試劑

人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細胞株購自北京中科院腫瘤醫院中心細胞庫，最大耐藥倍數為12.47；RPMI-1640細胞培養基、EDTA和胰酶購自HyClone；胎牛血清購自Gibco；雷帕霉素、順鉑和二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma；噻唑藍(MTT)購自上海生工公司；Transwell Permeable Supports購自Corning；Matrigel基質膠購自B&D；Annexin V細胞凋亡試劑盒購自北京鼎國公司；兔抗人beclin-1、LC3和β-actin多克隆抗體購自Abcam；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG II抗、ECL化學發光試劑購自北京碧云天公司；其它試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細胞株的培養 將購買的人肺腺癌A549細胞及其耐藥A549/DDP細胞株在含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗的RPMI-1640細胞培養基中培養，并置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中。隔12 h換新培養基1次，待細胞長滿培養瓶80%左右后進行細胞傳代和凍存。將傳代的A549及A549/DDP細胞進行連續培養以備實驗使用。

2.2 MTT方法檢測細胞增殖抑制率 將處于對數生長期的A549及A549/DDP細胞經含0.25%胰蛋白酶消化后進行細胞計數，并用RPMI-1640細胞培養基稀釋細胞濃度為5×107/L接種于96孔板中，每孔為100 μL，每組同時設置6個復孔。細胞置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養24 h后棄去上清培養基，并先后分別在A549及A549/DDP細胞中加入含不同濃度的Rap(0、0.5、1、2、4 μmol/L)、不同濃度的DDP(0、5、10、15、10 μmol/L)及Rap與DDP的聯合作用組。設置調零組和空白對照組，連續培養48 h。每孔加入20 μL MTT(5 g/L)溶液繼續溫育4 h，后棄去上清，每孔加入150 μL DMSO振蕩15 min，在酶聯免疫檢測儀檢測570 nm處各孔吸光值(A)，并計算各組細胞的生長抑制率。按公式計算各組細胞生長抑制率(%)=[1-(加藥組A值-調零A值)/(對照組A值-調零A值)]×100%。

2.3 Transwell實驗檢測細胞體外侵襲能力 將各組分別用10 μmol/L DDP、2 μmol/L Rap、10 μmol/L DDP+2 μmol/L Rap預處理及對照組的A549細胞及其耐藥A549/DDP細胞用0.25%含EDTA的胰酶消化液消化，離心后收集細胞并用RPMI-1640細胞培養基稀釋細胞濃度為5×108/L。分別在各組Transwell板上室膜上涂勻1 g/L的Matrigel膠50 μL，并置于37 ℃、30 min使之在微孔膜上重塑成基底膜結構。將稀釋的A549和A549/DDP細胞每組取100 μL接種于Transwell上室內，下室加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培養基600 μL，每組設置3個重復，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h。結束后，用4%多聚甲醛固定小室濾膜，用棉簽擦去上表面的細胞，然后用結晶紫染色10 min后用PBS清洗2遍，在200倍顯微鏡下觀察每組濾膜上穿過膜侵襲的細胞，并隨機拍照計數計算各組腫瘤細胞侵襲抑制率。侵襲抑制率(%)=(1-處理組平均侵襲細胞數/對照組平均侵襲細胞數)×100%。

2.4 細胞黏附實驗檢測細胞黏附能力變化 在96孔板中每孔加入100 μL Matrigel膠(1 g/L)，4 ℃下處理過夜后吸出Matrigel膠，37 ℃放置1 h。在Matrigel預處理的96孔板中每孔分別接種1×108/L的A549及A549/DDP細胞200 μL。設置空白對照組、10 μmol/L DDP組、2 μmol/L Rap組和10 μmol/L DDP+2 μmol/L Rap組，每組6個復孔。于37 ℃、5% CO2培養箱中培養0.5 h后棄去培養基并用PBS清洗2遍后(參照組不處理)，加入100 μL培養液和20 μL MTT(5 g/L)，在37 ℃孵育4 h后，吸出上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min后，在酶聯儀上測定490 nm波長時A值，計算各組細胞黏附率(%)=實驗組黏附細胞A值/參照組黏附細胞A值×100%

2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 將對數生長期的A549及A549/DDP細胞消化后分別接種于6孔板中，培養12 h細胞貼壁后，各自分成4組，即control組(PBS對照)、Rap組(2 μmol/L Rap)、DDP組(10 μmol/L DDP組)和Rap與DDP聯合組(10 μmol/L DDP+2 μmol/L Rap)，分別作用48 h后用PBS洗滌3次后，消化離心收集細胞。按照Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒操作，先用500 μL PBS重懸各組細胞，再加入5 μL FITC標記的Annexin V和5 μL PI混勻避光孵育20 min，用PBS洗滌1次后，離心并用150 μL重懸細胞。運用流式細胞術檢測各組細胞的凋亡率。

2.6 Western blotting檢測細胞自噬 利用Western blotting檢測細胞自噬標志蛋白beclin-1和LC3的表達。取對數生長期的A549及A549/DDP細胞，消化后用含10%的胎牛血清的RPMI-1640培養基培養并各分成4組處理。Control組加入PBS為對照， DDP處理組加入濃度為10 μmol/L的DDP， Rap處理組加入濃度為2 μmol/L 的Rap，而Rap和DDP聯合處理組加入10 μmol/L DDP+2 μmol/L Rap，作用48 h后分別收集各組A549及A549/DDP細胞。用預冷PBS洗滌2次后，各加入100 μL的RIPA細胞裂解液振蕩混勻后冰上裂解15 min提取細胞中總蛋白。后利用BCA試劑盒測定各組中細胞總蛋白濃度。各組上樣30 μg總蛋白進行12%的SDS-PAGE 2 h，電泳結束后進行半干法轉PVDF膜，用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h后分別孵育兔抗人多克隆beclin-1、LC3和β-actin的I抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜后TBST溶液洗滌10 min 3次，加入HRP標記山羊抗兔II抗(1∶5 000),室溫孵育2 h后TBST溶液洗滌10 min 3次。利用化學發光ECL試劑顯影，曝光拍照。細胞自噬標志物beclin-1和LC3蛋白表達強度用Quantity One軟件分析目的條帶和內參照β-actin條帶的灰度值表示。

3 統計學處理

所有實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表示。采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析，多組間數據比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 雷帕霉素和順鉑對A549及A549/DDP細胞增殖的影響

如表1所示，與control對照組相比，不同濃度的Rap均能抑制A549及A549/DDP細胞增殖，增加細胞增殖抑制率。不同濃度Rap間，當Rap濃度大于2 μmol/L時能同時顯著抑制A549及耐藥A549/DDP細胞增殖(P<0.05)。但Rap對耐藥A549/DDP細胞增殖抑制效應明顯弱于同濃度組的A549細胞(P<0.05)。而不同濃度的DDP均能顯著抑制A549細胞的增殖(P<0.05)，但其對耐藥A549/DDP細胞增殖抑制效應不明顯，僅當DDP濃度大于15 μmol/L時，不同濃度組間A549/DDP細胞增殖才受顯著抑制。同時同濃度組的DDP對A549/DDP細胞的抑制效應均顯著低于A549細胞(P<0.05)，驗證了耐藥A549/DDP細胞對順鉑具有強耐藥性，見表2。為了揭示Rap和DDP聯合作用對A549及A549/DDP細胞增殖的影響，利用MTT檢測了2 μmol/L Rap和不同濃度DDP聯合作用對A549及A549/DDP細胞增殖抑制率，結果見圖1。研究發現與2 μmol/L Rap單獨作用組相比，Rap和DDP聯合作用均能顯著抑制A549細胞的增殖(P<0.05)；而聯合作用DDP濃度大于10 μmol/L時，Rap和DDP聯合作用同樣能夠顯著抑制耐藥A549/DDP細胞增殖(P<0.05)。因此，選擇2 μmol/L Rap和10 μmol/L DDP研究其聯合作用對人肺腺癌細胞株A549及耐藥A549/DDP細胞的影響。

表1 不同濃度的雷帕霉素作用48 h對人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細胞增殖抑制率的影響

Table 1.The inhibitory effect of rapamycin at different concentrations on the proliferation of A549 and A549/DDP cells (%.Mean±SD.n=6)

CellsRapconcentration(μmol/L)00.5124A5491.48±0.4310.32±2.4113.67±1.8727.86±2.13*39.67±2.43*A549/DDP1.20±0.236.25±0.23#8.37±1.87#16.29±1.04*#28.33±1.89*#

TableP<0.05vsother concentrations of Rap;#P<0.05vsA549 cells.

表2 不同濃度的順鉑作用48 h對人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細胞增殖抑制率的影響

Table 2.The inhibitory effect of DDP at different concentrations on the proliferation of A549 and A549/DDP cells (%.Mean±SD.n=6)

CellsDDPconcentration(μmol/L)05101520A5492.25±0.8526.65±1.25*43.35±1.28*53.65±3.23*67.83±2.45*A549/DDP1.68±0.646.67±1.83#10.38±2.65#14.48±1.84#21.48±2.23*#

TableP<0.05vsother concentrations of DDP;#P<0.05vsA549 cells.

Figure 1.The inhibitory effects of Rap combined with DDP for 48 h on the proliferation of A549 and A549/DDP cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsRap group.

圖1 雷帕霉素和順鉑聯合作用48 h對人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細胞增殖抑制率的影響

2 雷帕霉素和順鉑對A549及A549/DDP細胞侵襲的影響

如圖2所示，與control組相比，10 μmol/L DDP單獨作用能夠顯著抑制A549細胞的體外侵襲能力，但對于耐藥A549/DDP細胞作用不明顯；2 μmol/L Rap單獨作用對A549及A549/DDP細胞體外侵襲能力均有抑制作用；而2 μmol/L Rap和10 μmol/L DDP聯合作用組中，A549及A549/DDP細胞體外侵襲能力均受到顯著抑制，均強于單獨作用組。對各組細胞侵襲抑制率進行統計，DDP單獨作用對A549細胞侵襲的抑制作用明顯(P<0.05)，但對于耐藥A549/DDP細胞卻無明顯作用。與Rap和DDP單獨作用組相比，Rap與DDP聯合作用組可以顯著增加對A549及A549/DDP細胞的侵襲抑制率(P<0.05)，說明Rap可以提升DDP對耐藥A549/DDP細胞發揮侵襲抑制作用，且具有協同效應。

3 雷帕霉素和順鉑對A549及A549/DDP細胞黏附的影響

細胞黏附實驗檢測發現Rap和DDP聯合作用同樣可以顯著抑制A549及耐藥A549/DDP細胞的黏附能力，結果見圖3。與control組相比，10 μmol/L DDP單獨作用對A549細胞的黏附能力均有顯著抑制效應(P<0.05)，但對耐藥A549/DDP細胞黏附抑制無明顯作用。而2 μmol/L Rap作用于A549及A549/DDP細胞，對其黏附抑制能力均有明顯抑制作用(P<0.05)。當Rap和DDP同時作用于A549及耐藥A549/DDP細胞時，對細胞黏附抑制率顯著提高，均高于Rap和DDP單獨作用組(P<0.05)。

Figure 2.The invasion ability of A549 and A549/DDP cells treated with Rap and DDP by Transwell assay. A: the invasion ability of A549 and A549/DDP cells detected by Transwell assay (×100).B: the results of quantitative analysis. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsDDP or Rap.

圖2 Transwell檢測雷帕霉素和順鉑對A549及A549/DDP細胞侵襲能力的影響

Figure 3.The adhesion ability of A549 and A549/DDP cells treated with Rap and DDP. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsDDP or Rap.

圖3 雷帕霉素和順鉑對A549及A549/DDP細胞黏附能力的影響

4 雷帕霉素和順鉑對A549及A549/DDP細胞凋亡的影響

與control組相比，2 μmol/L Rap和10 μmol/L DDP單獨作用于A549細胞時，均能顯著促進細胞凋亡(P<0.05)；而Rap和DDP聯合作用對A549細胞凋亡促進作用更加明顯，均高于單獨作用組(P<0.05)，說明Rap和DDP促進A549細胞凋亡具有協同效應。與control組相比，10 μmol/L DDP單獨作用于A549/DDP細胞時，細胞凋亡效應不明顯，說明了A549/DDP細胞的耐藥性。而當2 μmol/L Rap和10 μmol/L DDP同時作用于A549/DDP細胞時，耐藥A549/DDP細胞的凋亡率卻顯著增加(P<0.05)。說明在Rap的作用下可以逆轉耐藥A549/DDP細胞對DDP的耐藥性，見圖4。

Figure 4.The apoptosis of A549 and A549/DDP cells treated with Rap and DDP. A: the apoptosis of A549 and A549/DDP cells detected by flow cytometry.B: the quantitative analysis of apoptotic rates. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsDDP or Rap.

圖4 雷帕霉素和順鉑對A549及A549/DDP細胞凋亡的影響

5 雷帕霉素和順鉑對A549及A549/DDP細胞自噬的影響

利用Western blotting檢測細胞自噬標志蛋白beclin-1和自噬體雙層膜形成蛋白LC3的表達，可以檢測Rap和DDP對人肺腺癌細胞株A549及耐藥A549/DDP細胞自噬的影響，結果見圖5。與control組相比，DDP和Rap單獨處理A549細胞可以顯著誘導自噬標志蛋白beclin-1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的表達(P<0.05)。而Rap和DDP同時作用于A549細胞時，beclin-1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達均顯著高于DDP或Rap單獨作用組(P<0.05)，說明Rap和DDP聯合作用可以促進A549細胞自噬。當DDP單獨作用于耐藥A549/DDP細胞時，自噬標志蛋白beclin-1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白均未見明顯的表達變化，說明DDP對A549/DDP細胞自噬影響不明顯。但Rap作為自噬活化劑，對耐藥A549/DDP自噬仍然具有顯著誘導作用，可以顯著誘導自噬標志蛋白beclin-1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(P<0.05)。當Rap和DDP聯合作用于A549/DDP細胞時，與單獨作用組相比，自噬標志蛋白beclin-1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達顯著上升(P<0.05)，說明Rap可以促進DDP對耐藥A549/DDP細胞發揮自噬誘導作用，同時DDP對Rap發揮自噬誘導具有協同作用。

Figure 5.The autophagy of A549 and A549/DDP cells treated with Rap and DDP. A: the autophagy of A549 and A549/DDP cells detected by Western blotting； B: the ratio of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ； C: the relative protein expression of beclin-1. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsDDP or Rap.

圖5 雷帕霉素和順鉑對A549及A549/DDP細胞自噬的影響

討 論

目前，針對肺癌腫瘤的治療不斷有新化療藥物出現并且方案也更趨于完善，但肺癌細胞常常對化療藥物產生原發性或繼發性耐藥效應，從而導致腫瘤細胞轉移、復發和化療失敗[7]。如何有效增加化療藥物的敏感性并抑制肺癌細胞的耐藥性是當前亟需解決的難題。有數據表明[8]，DDP作為廣泛使用的化療藥物在多種惡性腫瘤治療中均有較好效果，但NSCLC極易對順鉑藥物產生耐藥性。因此，臨床上尋找可抵抗NSCLC對DDP耐藥的方法和提升DDP化療效果對于肺癌患者具有重要意義。本研究以NSCLC耐藥標準細胞系A549和A549/DDP細胞為研究對象，觀察在Rap干預下DDP對A549及耐藥A549/DDP細胞增殖、遷移、黏附等細胞功能的影響變化，以揭示Rap能否對肺癌細胞A549/DDP的耐藥性產生抵抗作用并增強DDP的藥性。

A549細胞為對化療藥物敏感細胞株，而A549/DDP細胞為化療藥物耐受性細胞株[9]。當用相同濃度DDP同時處理A549和A549/DDP細胞時，DDP對A549細胞的增殖抑制率均顯著高于耐藥A549/DDP細胞，驗證了A549/DDP細胞對DDP的耐藥性。Rap作為臨床免疫抑制劑，可通過影響mTOR信號通路抑制多種腫瘤細胞的增殖和細胞周期，但關于其對肺癌細胞的功能影響研究尚較少[10]。在本研究中當Rap濃度大于2 μmol/L時，對A549和A549/DDP細胞增殖均能產生顯著抑制作用，因此選擇2 μmol/L Rap和不同濃度的DDP聯合作用研究其對A549和A549/DDP增殖抑制率的影響變化。當Rap和不同濃度DDP聯合作用時，A549細胞的增殖抑制率均顯著高于同濃度DDP單獨作用組；而當聯合作用DDP濃度大于10 μmol/L時，耐藥A549/DDP細胞的增殖也受到顯著抑制，但同濃度DDP單獨作用對耐藥A549/DDP細胞的增殖無明顯影響。說明Rap可以提升DDP對A549及耐藥A549/DDP細胞的敏感性。

肺癌細胞的侵襲轉移是肺癌腫瘤惡性的生物標志，也常常是肺癌病人治療失敗和死亡的主要原因[11]。本研究利用Transwell實驗發現人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細胞在體外均具有較強侵襲能力，而當DDP和Rap單獨作用于A549細胞時，細胞侵襲能力均受顯著抑制，但DDP單獨作用對耐藥A549/DDP細胞的侵襲能力無明顯影響。當Rap和DDP聯合作用時，耐藥A549/DDP細胞的體外侵襲能力卻能顯著下降，說明在Rap的作用下能夠提升DDP對耐藥A549/DDP細胞的侵襲抑制能力。而Rap和DDP聯合作用對A549及A549/DDP的侵襲抑制能力均顯著高于Rap和DDP各自單獨作用組，說明Rap和DDP對抑制細胞體外侵襲能夠發揮協同作用。同時肺癌細胞的轉移機制不僅與侵襲能力有關，還涉及到細胞的黏附能力[12]。有研究指出，腫瘤細胞黏附力的強弱動態調節在腫瘤細胞的運動、轉移和侵襲過程中發揮重要作用[13]。本文證實人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細胞均具有較強黏附能力，與未處理對照組相比，DDP和Rap單獨作用對A549細胞有明顯的黏附抑制作用，且DDP發揮作用比Rap更明顯。對耐藥的A549/DDP細胞，DDP單獨作用對其細胞黏附能力影響作用不明顯，只有當Rap和DDP聯合作用時耐藥A549/DDP細胞的黏附能力才受顯著抑制，且均高于Rap和DDP單獨作用組，再次說明Rap可以作為DDP抑制耐藥性肺腺癌A549/DDP細胞黏附能力的增敏劑。

細胞自噬，是亞細胞水平的自我吞噬，當細胞處于外界刺激或饑餓狀態下時可通過消化自身細胞器清除細胞內垃圾，為細胞的再循環提供能量，因此低水平的細胞自噬在特定細胞環境下是一種自身保護機制，但當大量自噬發生時卻能夠誘導細胞凋亡[14]。細胞自噬在維持細胞自身穩態中起著重要作用，而細胞自噬功能異常在腫瘤發生、發展中也扮演重要角色。前期研究表明[15]，細胞自噬作用既能使某些腫瘤細胞耐受應激刺激而獲得更好生存，也能夠發揮腫瘤抑制機制殺死腫瘤細胞，在腫瘤發展過程中起著抑制和促進的雙重作用并可能相互轉換。但針對許多相關腫瘤的研究也表明[16]，腫瘤細胞的自噬能力常常低于正常細胞，而誘導腫瘤細胞的自噬活性能夠促進細胞凋亡水平，提示能夠通過誘導腫瘤細胞的自噬水平來防治腫瘤惡化。Beclin-1是細胞自噬作用中的關鍵蛋白，也是自噬的直接執行者，常被作為細胞自噬檢測的標記蛋白[17]。LC3也是檢測細胞自噬體形成的特異性標記蛋白，當細胞自噬形成時LC3可由胞漿型LC3-Ⅰ轉變成自噬體膜型LC3-Ⅱ，而LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可估計細胞自噬水平的高低[18]。因此，本研究利用Western blotting檢測Rap和DDP誘導處理人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細胞中beclin-1和LC3蛋白的表達以揭示其對細胞自噬的影響變化。在未處理對照組中A549及耐藥A549/DDP細胞中自噬標志蛋白beclin-1表達和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均較小，說明人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細胞中自身自噬水平較低。當用自噬誘導劑Rap處理A549及耐藥A549/DDP細胞時，beclin-1蛋白表達及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均有所上升；而DDP單獨作用A549細胞時，細胞自噬水平同樣上升，但對耐藥A549/DDP細胞自噬水平影響不明顯，說明耐藥A549/DDP細胞對DDP化療藥物的耐受性也可能與抑制細胞自噬作用有關。而當Rap和DDP聯合作用時，A549及耐藥A549/DDP細胞中自噬標記蛋白beclin-1表達和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均顯著上升且高于Rap單獨誘導組，說明Rap可以刺激DDP對耐藥A549/DDP細胞自噬發揮促進作用。另研究表明，當細胞自噬水平發生變化會影響細胞增殖、遷移、黏附、凋亡等細胞功能，而自噬與惡性腫瘤侵襲轉移具有相關性[19]。本研究中Rap和DDP聯合作用時，A549及耐藥A549/DDP細胞增殖抑制率、侵襲抑制能力、黏附抑制能力及細胞凋亡率均顯著上升，和其誘導細胞自噬水平具有一致性，說明Rap可以通過提升DDP對人肺腺癌A549及耐藥A549/DDP細胞的自噬誘導作用，從而抑制細胞增殖、侵襲、黏附并促進細胞凋亡。因此，通過本研究首次發現Rap和DDP聯合作用可以降低耐藥A549/DDP細胞的耐藥性并提高化療藥物DDP的敏感性，對于臨床治療非小細胞肺癌具有重要的指導意義。

[1] Shackelford DB, Abt E, Gerken L, et al. LKB1 inactivation dictates therapeutic response of non-small cell lung cancer to the metabolism drug phenformin[J]. Cancer Cell, 2013, 23(2):143-158.

[2] 劉換新, 吳曉霞, 張 燕, 等. 鉀離子通道蛋白 Kir2. 1/KCNJ2 及多藥耐藥蛋白 MRP1/ABCC1 在小細胞肺癌中的表達及相關性[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(11):1940-1945.

[3] Valle J, Wasan H, Palmer DH, et al. Cisplatin plus gemcitabine versus gemcitabine for biliary tract cancer[J]. New Engl J Med, 2010, 362(14): 1273-1281.

[4] Tang CH, Parham C, Shocron E, et al. Picoplatin overcomes resistance to cell toxicity in small-cell lung cancer cells previously treated with cisplatin and carboplatin[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2011, 67(6):1389-1400.

[5] 許成芳, 李小毛, 李 田, 等. 雷帕霉素增強子宮內膜癌細胞對阿霉素的敏感性[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(11):2090-2095.

[6] 李文艷, 朱 珺. 雷帕霉素對人非小細胞肺癌細胞株 A549 生長及增殖的影響[J]. 上海交通大學學報：醫學版, 2011， 31(3):275-278.

[7] Joshi M, Liu X, Belani CP. Taxanes, past, present, and future impact on non-small cell lung cancer[J]. Anti-cancer Drugs, 2014, 25(5):571-583.

[8] Gao Y, Baird AM, Barr M, et al. Epigenetic therapy for cisplatin resistance in non-small-cell lung cancer: the way forward?[J]. Lung Cancer Mgt, 2013, 2(1):1-4.

[9] Wang Q, Zhong M, Liu W, et al. Alterations of micro-RNAs in cisplatin-resistant human non-small cell lung cancer cells (A549/DDP)[J]. Exp Lung Res, 2011, 37(7):427-434.

[10]鄧守恒, 喻雄杰, 柯賢柱, 等. 雷帕霉素增強 Ishikawa 細胞化療敏感性實驗研究[J]. 武漢大學學報：醫學版, 2012, 33(1):55-58.

[11]Ramer R, Bublitz K, Freimuth N, et al. Cannabidiol inhibits lung cancer cell invasion and metastasis via intercellular adhesion molecule-1[J]. FASEB J, 2012, 26(4):1535-1548.

[12]Yang X, Popescu NC, Zimonjic DB. DLC1 interaction with S100A10 mediates inhibition ofinvitrocell invasion and tumorigenicity of lung cancer cells through a RhoGAP-independent mechanism[J]. Cancer Res, 2011, 71(8): 2916-2925.

[13]Chien ST, Lin SS, Wang CK, et al. Acacetin inhibits the invasion and migration of human non-small cell lung cancer A549 cells by suppressing the p38α MAPK signaling pathway[J]. Mol Cell Biochem, 2011, 350(1-2):135-148.

[14]呂 雷, 林 康, 高偉陽, 等. 饑餓誘導增生性瘢痕成纖維細胞自噬發生[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(2):330-333.

[15]蔣 倩, 羅招陽, 張志偉, 等. 自噬與腫瘤關系的研究與進展[J]. 現代生物醫學進展, 2013, 13(14):2783-2785.

[16]Xiong HY, Guo XL, Bu XX, et al. Autophagic cell death induced by 5-FU in Bax or PUMA deficient human colon cancer cell[J]. Cancer Lett, 2010,288(1):68-74.

[17]Kang R, Zeh HJ, Lotze MT, et al. The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis[J]. Cell Death Differ, 2011, 18(4):571-580.

[18]Tanida I, Minematsu-Ikeguchi N, Ueno T, et al. Lysosomal turnover, but not a cellular level, of endogenous LC3 is a marker for autophagy[J]. Autophagy, 2005, 1(2):84-91.

[19]翁軍權, 侯勁松. 自噬與惡性腫瘤侵襲轉移的相關性[J]. 國際腫瘤學雜志, 2012, 39(6):408-411.

Effect of rapamycin on proliferation, invasion, adhesion, apoptosis and autophagy of human lung adenocarcinoma A549 and resistant A549/DDP cells treated with cis-diamminedichloroplatinum

JIN Zhu, GAO Bao-an

(DepartmentofRespiratoryMedicine,YichangCentralPeople’sHospital,TheFirstClinicalMedicalCollegeofChinaThreeGorgesUniversity,Yichang443003,China.E-mail: 222xiaozhao@163.com)

AIM: To study the effect of rapamycin (Rap) on the proliferation, invasion, adhesion, apoptosis and autophagy of human adenocarcinoma A549 and resistant A549/DDP cells treated with cis-diamminedichloroplatinum (DDP). METHODS: Human adenocarcinoma A549 and resistant A549/DDP cell lines were cultured. The inhibitory effects of Rap alone or combined with DDP on A549 and resistant A549/DDP cells were detected by MTT assay. Theinvitroinvasion abilities of the 2 cell lines treated with Rap alone or combined with DDP were detected by Transwell methods. Theinvitroadhesion abilities of the 2 cell lines treated with Rap alone or combined with DDP were detected by adhesion experiments. The apoptosis of A549 and resistant A549/DDP cells induced by Rap alone or combined with DDP was analyzed by flow cytometry. The cell autophagy marker proteins beclin-1 and LC3 in A549 and resistant A549/DDP cells treated with Rap alone or combined with DDP were detected by Western blotting.RESULTS: Compared with Rap or DDP alone group, the combination of Rap and DDP significantly inhibited the proliferation, invasion and adhesion of A549 and resistant A549/DDP cellsinvitro, and promoted the cell apoptosis and autophagy marker proteins beclin-1 and LC3 expression (allP<0.05).CONCLUSION: Rap enhances the effect of DDP through promoting the cell autophagy, thereby inhibiting the proliferation, invasion and adhesion of A549 and resistant A549/DDP cells and inducing the cell apoptosis with a synergistic effect.

Rapamycin; Cis-diamminedichloroplatinum; Human lung adenocarcinoma cells; Apoptosis; Cell invasion; Autophagy

1000- 4718(2014)12- 2120- 08

2014- 09- 23

2014- 10- 22

湖北省自然科學基金資助項目(No. 2011CDB178)；湖北省教育廳中青年人才基金資助項目(No. Q20111202)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.002

△通訊作者Tel: 0717-6526428； E-mail：222xiaozhao@163.com