血漿中多基因聯合甲基化檢測在肺癌診斷中的應用*

丁 浩， 沈志高， 李 昊， 邱 宇， 郝曉寧， 祖金池， 鐘 理, 2△

(1河北大學生命科學學院生物芯片研究室，河北 保定 071002； 2Western University of Health Science，California 91766，USA; 3河北大學附屬醫院，河北 保定 071002)

血漿中多基因聯合甲基化檢測在肺癌診斷中的應用*

丁 浩1， 沈志高1， 李 昊1， 邱 宇1， 郝曉寧1， 祖金池3， 鐘 理1, 2△

(1河北大學生命科學學院生物芯片研究室，河北 保定 071002；2Western University of Health Science，California 91766，USA;3河北大學附屬醫院，河北 保定 071002)

目的： 探究血漿中CDH13、RASSF13A、DLEC13、SEPT13、RUNX13等抑癌基因啟動子甲基化及其聯合檢測在肺癌診斷中的價值。從中選出診斷效能高的組合。方法: 采用巢式甲基化特異性PCR(nest methylation specific PCR，nMSP)法，檢測106例健康人血漿樣本、106例肺癌組織和癌旁組織以及其對應的106例術前血漿樣本、中基因啟動子區的甲基化狀態。對血漿基因組DNA修飾后進行多重置換擴增 (multiple displacement amplification, MDA)，以解決血漿DNA模板不足的問題。結果: 肺癌組織樣本中的CDH13、RASSF13A、DLEC13、SEPT13、RUNX13基因啟動子甲基化率分別為51.9%、44.3%、54.7%、36.8% 、24.5%。對應的血漿樣本中的CDH13、RASSF1A、DLEC1、SEPT9、RUNX3基因啟動子甲基化率分別為46.2%、41.5%、50.9%、31.1%、19.8%。Kappa一致性檢驗結果表明肺癌組織與血漿的甲基化檢出率一致。CDH13、DLEC1、RASSF1A、SEPT9組合對肺癌的診斷效能明顯高于其它組，準確度ACC為82.08%，Youden指數為0.6415(靈敏度為79.49%，特異度為81.13%)。結論: 血漿多基因聯合甲基化檢測有望應用于肺癌早期診斷。

肺腫瘤； 血漿； 組織； 甲基化

肺癌是我國發病率和致死率最高的癌癥之一[1]。由于診斷手段的限制，大多患者在確診時已發展到中晚期，取得肺癌組織標本會給患者身體造成很大傷害，難以進行病理檢測。因此，亟需一種能實時、有效、無創的檢測手段，進行肺癌的診斷。肺癌的發生是各種遺傳信息改變和環境因素累積作用的結果。表觀遺傳學研究表明，肺癌的發生可能與抑癌基因啟動子區CpG島的甲基化相關[2]。CpG島的異常高甲基化是導致人類抑癌基因的轉錄失活的機制之一，在所有人的血漿中均存在，由于應激反應所致，其在病人血漿中含量顯著高于健康人[3]。肺癌患者血漿中的循環DNA主要來源于腫瘤細胞[4]，其分子生物學特征與原發灶相一致[5]。因此，檢測血漿中相關抑癌基因的甲基化，有望成為臨床上肺癌診斷的有效手段。

本研究采用巢氏甲基化特異性PCR技術檢測肺癌患者血漿(術前)、健康人血漿、肺癌組織和癌旁組織中 H-鈣黏素 13 (H-cadherin 13，CDH13)、runt相關轉錄因子(runt-related transcription factor 3，RUNX3)、ras相關區域家族(ras-associated domain family 1A，RASSF1A)、DLEC1 (deleted in lung and esophageal cancer 1)及 septin 9(SEPT9)等抑癌基因啟動子的甲基化狀況?？偨Y各基因甲基化狀態與肺癌臨床診斷的關系，比較2種取材檢測結果的相關性，探究血漿作為臨床取材的可行性，探討各基因作為肺癌診斷標志物的可能性，綜合靈敏度和特異性，選擇一組基因甲基化標志物應用于肺癌臨床診斷。

材 料 和 方 法

1 臨床資料

材料均取自術前未經放化療，且無其它腫瘤病史的肺癌患者。收集2013年2月～2014年10月保定市第一中心醫院和河北大學附屬醫院106例肺癌患者的肺癌組織、癌旁組織(距癌組織> 3cm)以及術前血液樣本，其中男72例，女34例；年齡35～84歲，中位年齡61歲。另采集106份健康人血液樣品作對照。

2 樣品的收集處理

肺癌組織標本收集后立即放入液氮中，之后放置于超低溫冰箱。血液樣本用枸櫞酸鈉藍色真空采血管收集，采血6 h內4 000 r/min離心10 min分離血漿；取上清，4 ℃條件下，再次以10 000 r/min離心15 min獲得血漿，用1.5 mL離心管以每管200 μL分裝。

3 主要方法

3.1 基因組DNA的提取 采用DNAiso reagent(TaKaRa)提取組織中的基因組DNA，血漿DNA的提取按照QI Aamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen)的血液或體液檢測方案進行，用50 μL AE 洗脫 DNA。Nanodrop 2000C及瓊脂糖凝膠電泳測濃度純度，A260/A280值為1.79～1.87。

3.2 基因組DNA的修飾 采用EZ DNA Methylation-Gold Kit(Zymo Research)每次修飾1 μg組織基因組DNA，200 ng血漿基因組DNA，用10 μL M-Elution buffer洗脫。

3.3 血漿DNA多重置換擴增 (multiple displacement amplification，MDA) 使用Epi Tect Whole Bisulfitome Kit擴增試劑盒(Qiagen)對修飾后的血漿DNA進行全基因組擴增。

3.4 巢氏甲基化特異性PCR及電泳檢測 運用Methprimer 軟件設計nMSP的引物序列。在重亞硫酸鹽測序(bisulfite sequencing PCR，BSP)條件下設計外側引物，在甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR,MSP)條件下分別設計甲基化(M)引物和非甲基化(U)引物。引物由蘇州金唯智公司合成，引物序列、產物大小和退火溫度等見表1。LA Taq with GC buffer(TaKaRa)，25 μL反應體系：LA Taq 0.25 μL，2×GC bufferⅡ 12.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，修飾后的DNA模板0.5 μL，10 mmol/L的上下游引物各0.75 μL，加入ddH2O定容至25 μL。第1輪PCR的反應條件為95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，各基因按各自溫度 30 s，72 ℃ 2 min，共40個循環；72 ℃ 5 min。第1輪PCR后，取5 μL產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像檢測。第2輪PCR反應，取0.5 μL第1輪PCR產物作為模板(稀釋50倍)，取10 mmol/L的甲基化、非甲基化上下游引物各1 μL，退火溫度見表1，其它條件相同擴增30次，電泳檢測。以經甲基化轉移酶M.SssI(Zymo Research)處理的健康人外周血單核細胞DNA作陽性對照，未經M.SssI處理的健康人外周血單核細胞DNA作陰性對照，以ddH2O代替模板作為空白對照。

4 甲基化結果判斷

第1輪PCR出現條帶；第2輪PCR甲基化引物出現條帶，非甲基化引物未出現條帶，該基因啟動子區判斷為甲基化。甲基化引物、非甲基化引物PCR均出現條帶(部分甲基化)，亦判斷為甲基化。甲基化引物未出現條帶，非甲基化引物出現條帶，則判斷為未甲基化。

表1 引物序列

5 統計學處理

使用SPSS 17.0軟件對各基因甲基化的情況進行計數，采用Fisher精確檢驗對肺癌樣本各基因甲基化狀態與臨床各種病理因素進行統計分析處理。Fisher精確檢驗比較肺癌組織和癌旁組織各基因甲基化率的差異性；Kappa一致性檢驗評價血漿和肺癌組織檢驗結果的一致性。靈敏度(%)=真陽性人數/(真陽性人數+假陰性人數)×100%；特異度(%)=真陰性人數/(真陰性人數+假陽性人數)×100%。以P<0.05為差異有統計學意義；κ>0.75為兩者具有一致性。

結 果

1 各樣本DNA甲基化檢測結果

首先用外側引物分別進行第1輪擴增，結果所有DNA樣本均可擴增出相應片段。然后分別用甲基化和非甲基化特異性引物進行第2輪擴增，結果顯示106例肺癌組織樣本中的CDH13、RASSF1A、DLEC1、SEPT9和RUNX3基因啟動子區甲基化分別為51.9%、44.3%、54.7%、36.8%和24.5%。106例癌旁組織樣本中的CDH13、RASSF1A、DLEC1、SEPT9和RUNX3基因啟動子區甲基化分別為10.4%、7.6%、5.7%、10.4%和11.3%。106例血漿樣本中的CDH13、RASSF1A、DLEC1、SEPT9和RUNX3基因啟動子區甲基化分別為46.2%、41.5%、50.9%、31.1%和19.8%。陽性對照和陰性對照均有特異性擴增產物。各基因nMSP的凝膠電泳結果見圖1。肺癌組織和癌旁組織各基因的甲基化率差異均有統計學意義(P<0.05)，其中RUNX3基因在2種組織中的甲基化檢出率比較差異有統計學意義(P<0.05)；而CDH13、RASSF1A、DLEC1和SEPT9的甲基化檢出率在2種組織中的差異亦有統計學意義(P<0.01)，見表2。Kappa一致性檢驗結果表明肺癌組織與血漿的甲基化率一致性明顯，見表3。

Figure 1.nMSP results ofCDH13 (A),RUNX3 (B),RASSF1A(C),DLEC1 (D),SEPT9 (E).

圖1CDH13、RUNX3、RASSF1A、DLEC1、SEPT9 基因的nMSP結果

表2 肺癌和癌旁組織中的基因甲基化情況

Table 2.Methylation frequencies for lung cancer and paracancerous tissues (%.n=106)

GeneCancertissuesParacanceroustissuesCDH1351.9**10.4**DLEC154.7**5.7**RASSF1A44.3**7.6**SEPT936.8**10.4**RUNX324.5*11.3*

TableP<0.05，**P<0.01vsnormal.

表3 肺癌組織與血漿甲基化率的相關性

Table 3.The correlation of methylation detection rates between plasma and the corresponding pathological tissues of the patients with lung cancer

Plasma CancertissuesMUKappavalueCDH13M4720.812△ U849DLEC1M5400.924△△ U448RASSF1AM4130.827△ U656SEPT9M3120.790△ U865RUNX3M1920.755△ U778

△κ>0.75，△△κ>0.90vsplasma.

2 各基因甲基化狀態與臨床病理特征的關系

本實驗發現肺癌組織CDH13甲基化率腺癌組高于其它組，差異有統計學意義(P<0.05)；有遠處轉移的組(M1)其CDH13甲基化率高于沒有遠處轉移的組(M0)(P<0.05)。原發腫瘤大小>T2的患者其RASSF1A甲基化率高于其它組(P<0.05)。DLEC1甲基化率鱗癌組高于其它組，差異有統計學意義(P<0.05)；有遠處轉移的組(M1)其DLEC1甲基化率高于沒有遠處轉移的組(M0)(P<0.05)。各基因甲基化與其它臨床病理參數無明顯相關(P>0.05)，見表4。

3 血漿中多基因聯合甲基化檢測的靈敏度和特異度

ROC曲線分析顯示，DLECI+CDH13+RASSF1A+SEPT9組的診斷準確度和Youden指數最高，分別為82.08%和64.15%。表明本研究中，血漿中DLEC1、CDH13、RASSF1A和SEPT9組合對肺癌的診斷效能明顯高于其它組(靈敏度為81.13%，特異度為83.02%)，見表5。

肺癌患者的CpG島甲基化表型 (CpG island methylator phenotype， CIMP)陽性(同一樣本存在3個及3個以上基因甲基化)率為57.55%。83.96% 的肺癌血漿樣本至少檢測到1個基因啟動子區甲基化；健康對照組的CIMP陽性率為9.43%；23.58%的健康人血漿樣本至少檢測到1個基因啟動子區甲基化，見表6。

表4 各基因甲基化狀態與臨床病理特征的相關性

TableP<0.05vsnormal.

表5 血漿中各基因組合甲基化的受試者工作曲線(ROC)分析

表6 肺癌患者和健康人血漿中CpG島甲基化表型(CIMP)的比較

Table 6.Comparison of CIMP between the plasma of lung cancer patients and normal controls

CIMPLungcancerpatientsNormalcontrols+57.55%(61/106)9.43%(10/106)-42.45%(45/106)90.57%(96/106)

討 論

腫瘤的發生、發展是一個多因素共同作用的復雜過程。癌癥的產生經過2條途徑：一是原癌基因的高表達，二是抑癌基因的低表達[6]。后者除與基因突變相關外，主要與表觀遺傳修飾有關，而DNA甲基化正是表觀遺傳修飾的主要形式[7]。DNA甲基化在腫瘤發生的早期即出現，在病灶未形成時，肺癌患者的血液及胸腔積液中可發現，且伴隨著腫瘤發展的整個過程，DNA甲基化有望成為診斷肺癌的分子標志物。CDH13、RUNX3、DLEC1、RASSF1A、SEPT9基因高甲基化在多種癌癥(包括肺癌)均檢測到[8-9]。但該5種基因未在同一樣本中同時檢測過，采用聯合檢測，可以有效提高標志物的靈敏度和特異度，旨在選出高效能肺癌分子標志物組合。血漿中的游離DNA主要來源于腫瘤細胞本身，本實驗評價了循環無細胞DNA(circulating cell-free DNA, cfDNA)與肺癌組織在診斷效能上相關性，證明血漿是一種理想的DNA甲基化檢測材料。因為在凝血的過程中白細胞破裂釋放的DNA會對cfDNA造成干擾，故在本研究中不使用血清[10]。

MSP是檢測基因啟動子區甲基化的常用方法，但是其靈敏度低，不適用于游離DNA的甲基化檢測[11]。本實驗采用 nMSP的方法，先用非特異性外側引物做1輪擴增；再分別用特異性內側甲基化引物和非甲基化引物做2輪擴增，能提高檢測的靈敏性和特異性。血漿中DNA的含量極少，陳潔等[12]測得正常對照組血漿DNA水平為(14.1±3.8) μg/L，肺癌組血漿DNA水平為15.3 μg/L～1 771.2 μg/L，經過亞硫酸氫鹽修飾，模板DNA又會損失一部分。而近年興起的多重置換擴增技術能通過全基因組擴增解決DNA模板濃度過低的難題[13]。為了保證血漿樣本PCR的成功率，我們在血漿基因組硫酸氫鹽修飾前都進行全基因擴增，取得了理想的實驗效果。

CDH13編碼黏附分子，在細胞黏附、細胞侵襲和轉移等方面具有重要作用。CDH13表達下調，能降低癌細胞的黏附力，從而促進腫瘤的生長和侵襲轉移[14]。本研究發現M1組的甲基化率與M0組比較，差異具有統計學意義，說明CDH13基因甲基化可能是造成肺癌轉移的一個重要原因。CDH13基因甲基化還與病理組織類型有關系，我們發現腺癌的甲基化率顯著高于其它的病理組織類型。

RASSF1A是常見的抑癌基因，其通過阻斷細胞周期蛋白D1的積累，導致蛋白激酶失活，從而阻止細胞分裂周期G1/S的進展，調控細胞周期[15]。本研究采用nMSP法測得血漿RASSF1A甲基化率為41.51%，這與Lee 等[16]用焦磷酸測序法測得的結果44.7%基本一致。但Lee的研究結果顯示吸煙患者的RASSF1A甲基化率高于非吸煙患者。而本研究得到的結果與其并不一致，可能與樣本數量和來源不同有關。

Levanon等[17]首先于1994年在急性髓性白血病中發現RUNX3基因。RUNX3蛋白是TGF-β信號通路的重要參與者，RUNX3表達下調會限制Smad功能進而影響該細胞信號通路的失調，使細胞增殖受控制，導致腫瘤的發生發展[18]。但該基因在肺癌中研究的并不多，Naoki等[19]用MSP法在NSCLC血漿中測得RUNX3的甲基化率為20%，與本實驗結果中19.81%的甲基化率一致。

DLEC1于1999年由Dalgo等[20]首次克隆發現，可能是Ser/Thr蛋白激酶信號通路中某一靶基因。DLEC1在肺癌中的研究很多，DLEC1甲基化是重要的肺癌分子標志物，其甲基化往往引起該基因表達下調[21]。本試驗發現DLEC1基因甲基化與病理組織類型、是否轉移有關。鱗癌的甲基化率顯著高于其它病理組織類型，發生轉移的患者DLEC1的甲基化率與未轉移的患者相比較，差異具有統計學意義。

Lofton等[22]研究發現SEPT9甲基化是顯著的結腸癌標志物，SEPT9基因的表達下調與啟動子區域的高度甲基化相關，導致癌細胞增殖和遷移。Powrózek等[23]用實時熒光定量甲基化特異性PCR的方法，測得游離SEPT9作為甲基化標志物在肺癌診斷中的靈敏性為44.3%，特異性為92.0%，說明SEPT9作為抑癌基因對肺癌診斷具有價值。本研究測得血漿游離SEPT9在肺癌診斷中的的靈敏性為31.13%，特異性為90.6%，與前人的結果略有差異，這是由于試驗方法的靈敏度和樣本來源差異造成的。

本實驗在肺癌組織和血漿中CDH13、RASSF1A、DLEC1、SEPT9和RUNX3這5種基因的甲基化狀態是基本一致的。且血漿中CDH13、RASSF1A、DLEC1和SEPT9組合的準確度ACC為82.08%，Youden指數為0.6415(靈敏度:79.49%，特異度:81.13%)，證明了血漿基因甲基化檢測在臨床肺癌篩查方面的可行性。而這種檢測方法實時微創，能大大減輕患者痛苦。因此，日后的研究重點在于擴大樣本量，以提高結果的科學性，并用高通量的手段篩選高靈敏度和特異度的DNA甲基化組合。相信不久的將來，血漿多基因的聯合甲基化檢測將廣泛應用于肺癌的早期診斷中。

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Application of multiple gene methylations in plasma for diagnosis of lung cancer

DING Hao1, SHEN Zhi-gao1, LI Hao1, QIU Yu1, HAO Xiao-ning1, ZU Jin-chi3, ZHONG Li1, 2

(1LaboratoryofBiochipofLifeScience,HebeiUniversity,Baoding071002,China;2WesternUniversityofHealthScience,California91766,USA;3AffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Baoding071002,China.E-mail:zhong_leehd@sina.com)

AIM: To determine the aberrant methylation status in the gene promoter regions ofCDH13,RASSF1A,DLEC1,SEPT9 andRUNX3 by detecting the plasma specimens and the value of their combined detection for diagnosis of lung cancers. METHODS: Nest methylation specific PCR (nMSP) was used to detect the promoter methylation status of the 5 genes in the plasma from 106 normal controls， lung cancer tissues, lung benign tissues and the plasma from 106 patients with lung cancers. Multiple displacement amplification (MDA) was used to amplify modified genomic DNA to solve the problem of insufficient of plasma DNA template. RESULTS: The positive rates of promoter methylation ofCDH13,RASSF1A,DLEC1,SEPT9 andRUNX3 in the lung cancer tissues were 51.9%, 44.3%, 54.7%, 36.8%, 24.5%, respectively, and those in the plasma were 46.2%, 41.5%, 50.9%, 31.1%, 19.8%, respectively. The results of the Kappa consistency check showed that the lung cancer tissues and the plasma had obviously coherence in the methylation status of the 5 gene promoter regions. Combination ofDLEC1,CDH13,RASSF1A, andSEPT9 had a higher diagnostic efficiency than the others, as their ACC value was 0.8208 and youden index was 0.6415 (with the sensitivity of 81.13% and the specificity of 83.02%). CONCLUSION: Combination detection of promoter methylation of lung cancer-related genes in the plasma is expected to apply to the early diagnosis of lung cancer.

Lung neoplasms; Plasma; Tissues; Methylation

1000- 4718(2014)12- 2128- 07

2014- 07- 01

2014- 10- 22

國家自然科學基金資助項目(No. 81272444; No. 81472744)

R446.1； R734.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.003

△通訊作者 Tel: 0312-5079365; E-mail: zhong- leehd@sina.com