結腸癌干細胞樣細胞的體外培養、鑒定及n-3多不飽和脂肪酸對結腸癌干細胞樣細胞的抗增殖作用*

方 仕， 龍健婷， 張 冰， 楊 婷， 盧 味， 李鶴平， 石漢平

(中山大學附屬第一醫院 1臨床營養科， 2腫瘤科， 3核醫學科， 5普通外科，廣東 廣州 510080； 4中山市人民醫院重癥治療科，廣東 中山 528400)

結腸癌干細胞樣細胞的體外培養、鑒定及n-3多不飽和脂肪酸對結腸癌干細胞樣細胞的抗增殖作用*

方 仕1， 龍健婷2， 張 冰3， 楊 婷4△， 盧 味1， 李鶴平2， 石漢平5

(中山大學附屬第一醫院1臨床營養科，2腫瘤科，3核醫學科，5普通外科，廣東 廣州 510080；4中山市人民醫院重癥治療科，廣東 中山 528400)

目的： 采取無血清培養法培養出SW620細胞球，并對細胞球細胞進行干細胞鑒定；在細胞水平研究n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFAs)對結腸癌干細胞樣細胞的作用。方法: 正常培養人結腸癌細胞株SW620并使其逐步適應無血清培養條件，經無血清培養1周后收集SW620細胞球。用免疫熒光法檢測胚胎干細胞標志物SSEA-1和TRA-1-81；采用real-time PCR的方法檢測干細胞相關基因Sox-2和Oct-4的表達情況；對比SW620貼壁細胞和干細胞樣細胞(CSCLC)在軟瓊脂上的克隆形成能力；采用裸鼠移植瘤模型比較2種細胞的成瘤能力；用MTS法對比2種細胞在遞增濃度的5-氟尿嘧啶(5-FU)或mitomycin C處理下的生長抑制情況；用MTS法、Annexin V/PI染色和臺盼藍染色分別觀察遞增濃度二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)作用于SW620 CSCLC后細胞生長抑制情況、凋亡情況和死亡情況；MTS法檢測5-FU或mitomycin C聯合n-3 PUFAs對結腸癌CSCLC增殖的影響。結果: 無血清培養法成功從SW620中培養出細胞球。細胞球細胞高表達SSEA-1和TRA-1-81并一過性表達Sox-2和Oct-4基因；對5-FU及mitomycin C相對抵抗；在軟瓊脂上克隆形成率及在裸鼠皮下的成瘤率均顯著高于貼壁細胞，表明這些細胞具有干細胞特性，即為來自于SW620的CSCLC。DHA和(或)EPA作用于SW620 CSCLC能抑制細胞生長、誘導細胞凋亡，并能增強5-FU及mitomycin C對其抑制作用。結論: 無血清培養法能夠從SW620細胞中培養出具有干細胞特性的細胞，它們具有高克隆形成能力及高致瘤性，對化療藥物相對抗拒；DHA和EPA能夠誘導SW620來源CSCLC發生凋亡并增強化療藥物的抗腫瘤活性。

結腸腫瘤； 腫瘤干細胞； 無血清培養； n-3多不飽和脂肪酸； 化學治療

結直腸癌(colorectal cancer, CRC)為起源于結直腸黏膜上皮的惡性腫瘤。根據美國的統計數字，進入2014年，預計將有71 830名男性和65 000名女性會被診斷為結直腸癌，而26 270名男性及24 040名女性將死于此病[1]。

Reya等[2]首次提出腫瘤干細胞(cancer stem cell, CSC)學說，認為惡性腫瘤組織中存在一群數量極少的具有干細胞樣特性的細胞，這群細胞具有自我更新、無限增殖以及多向分化潛能，而且對傳統的抗腫瘤治療相對抗拒，具有啟動和維持腫瘤的能力[3]。日益增加的證據顯示幾乎所有的實體瘤包括CRC都包含特有的CSC亞群，是導致術后轉移和復發、腫瘤耐藥及總生存下降的根源[4]。

n-3多不飽和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids, n-3 PUFAs)主要包括α-亞麻酸、二十碳五烯酸(eicosapentenoicacid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid, DHA)。多年來研究發現，n-3 PUFAs具有調節免疫反應、調節心血管功能、抗動脈硬化、抗炎、抗癌等多種特殊功效[5-6]。n-3 PUFAs已被用于多種惡性腫瘤的輔助治療，并證實其能通過改變腫瘤細胞生物膜結構和功能、增加腫瘤細胞內脂質過氧化物的產生、促進腫瘤細胞凋亡、調節機體免疫系統及增強化療藥物抗腫瘤效果等機制抑制腫瘤的發生、進展和轉移[7-10]。然而，n-3 PUFAs對CSC作用如何，是否能通過抑制CSC達到進一步抑制腫瘤的作用，是否能夠提高化療藥物對CSC的殺傷作用，這些問題國內外尚未見文獻報道。

本研究首先探討在體外大量培養、富集結腸癌干細胞樣細胞(cancer stem cell-like cells, CSCLC)的方法，并對其干細胞性進行鑒定；研究n-3 PUFAs在體外對結直腸癌CSCLC的作用。

材 料 和 方 法

1 細胞及動物

SW620人結腸癌細胞株購自中國科學院上海細胞生物研究所，正常培養于含有10%小牛血清、5×104U/L青霉素及50 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養基(Gibco)。培養在37 ℃、5% CO2的濕化培養箱內。逐步降低含血清培養基的比例直至無血清培養，約1周后獲得SW620細胞球。無胸腺裸鼠購自中山大學實驗動物中心。所有動物實驗均遵守中山大學《實驗動物管理條例》，并在實驗前獲得倫理委員會批準。

2 主要方法

2.1 免疫熒光胰酶消化貼壁生長的SW620細胞及細胞球 細胞制成單細胞懸液，制作細胞爬片，4%甲醛固定后以PBS清洗，5% BSA+10%山羊血清封閉后以SSEA-1或TRA-1-81抗體(Cell Signaling)孵育過夜，經PBS及蒸餾水振洗、吹干后滴加熒光素標記Ⅱ抗(1∶150)，室溫孵育60 min后行DAPI(Invitrogen)染色，封片后4 ℃避光干燥保存24 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2.2 Real-time PCR檢測Sox-2和Oct-4 mRNA表達 從細胞球細胞中用Trizol(Invitrogen)提取總RNA，以ReverTra Ace反轉錄酶(Toyobo)合成cDNA第1鏈，實時熒光定量PCR實驗應用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)在ABI Prism 7500測序儀(Applied Biosystems)中進行。Sox-2擴增引物序列如下：正義鏈為5′-ATGCACCGCTACGACGTGA-3′；反義鏈為 5′-CTTTTGCACCCCTCCCATTT-3′。Oct-4擴增引物序列如下：正義鏈為5′-CGACCATCTGCCGCTTTGAG-3′；反義鏈為 5′-CCCCCTGTCCCCCATTCCTA-3′。內參照基因為GAPDH。PCR過程簡述如下：95 ℃變性5 min；然后40個循環：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s。mRNA水平用2-ΔΔCt方法分析。

2.3 軟瓊脂克隆形成實驗 將1.32%低熔點瓊脂糖與2×細胞培養基以1∶1的體積比混合制備0.66%的底層瓊脂，6孔板中每孔1 mL，將0.66%的低熔點瓊脂糖與2×細胞培養基以1∶1的體積比混合制備0.33%的上層瓊脂，每孔加1 mL。消化貼壁細胞或細胞球細胞成單個細胞，調整單細胞懸液密度為1×107/L，在每孔瓊脂平面上加100 μL單細胞懸液(每孔1 000個細胞)。置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱內培養2～3周，計數含50個細胞以上的克隆，計算集落形成率(克隆數/接種細胞數×100%)。

2.4 裸鼠體內成瘤實驗 裸鼠分為3組(每組6只)，分別接種2×103、2×104和2×105的SW620貼壁細胞(右側皮下)，或細胞球細胞(左側皮下)，每3 d觀察腫瘤形成情況，連續觀察4周，處死后測量腫瘤大小。

2.5 細胞生長抑制實驗 DHA、EPA、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)及絲裂霉素C (mitomycin C)均購自Sigma；DMSO購自北京化工廠。細胞球細胞在96孔板中懸浮培養，加入含10 μmol/L、30 μmol/L、50 μmol/L、70 μmol/L的DHA、EPA或DHA+EPA，或含10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L mitomycin C，或2、4、6、8、10 mg/L 5-FU。活細胞琥珀酸脫氫酶能把外源性MTT還原成難溶的紫藍色formaza結晶并沉積在細胞里，而死細胞無此功能。Formaza結晶溶解于DMSO中，用酶標儀測定570 nm處吸光度(A)值。抑制率(%)=(未加藥組A-加藥組A)/未加藥組A×100%。

2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 取10 μmol/L、30 μmol/L、50 μmol/L、70 μmol/L的DHA、EPA或DHA+EPA處理過1 d的干細胞球，按照試劑說明書操作，以Annexin V和PI標記細胞，避光孵育后進行流式細胞儀檢測，每次計數10 000個細胞。

3 統計學處理

所有實驗均獨立重復至少3次。數據以均數±標準差(mean±SD)表示。統計方法采用單因素方差分析或t檢驗。統計軟件使用SPSS 18.0 。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 無血清培養方法得到的SW620細胞球高表達胚胎干細胞表面標志物及干細胞相關基因

SW620細胞于無血清培養液中培養3 d后，可見單層細胞中有些區域逐漸增厚，6～7 d即可離開多層貼壁細胞，最后懸浮于培養液中。鏡下觀察懸浮細胞結構致密、形態均一、核大、核仁清晰、核質比高，見圖1A。共聚焦顯微鏡下觀察，這些來自于細胞球的細胞膜表面表達SSEA-1和TRA-1-81胚胎干細胞標志物，其陽性率顯著高于貼壁培養的SW620細胞，見圖1B。Real-time PCR檢測干細胞相關基因Sox-2和Oct-4在SW620細胞無血清培養第1天至第7天的表達情況，結果表明SW620細胞在形成細胞球的過程中，Sox-2和Oct-4基因表現出啟動現象，其表達量在第2～3天最高，而在細胞球已經形成以后，這2個基因的表達量又恢復至培養之初的水平，表明SW620細胞在形成細胞球過程中由分化狀態轉入未分化狀態,見圖1C。

Figure 1.SW620 cell line-derived spheroid cells highly expressed embryonic stem cell markers. A: SW620 cells formed spheres in serum-free medium after acclimation gradually for 7 d; B: immunofluorescence staining of spheroid cells and adherent cells with antibodies against SSEA-1 (red) and TRA-1-81 (red); C: the expression levels of pluripotency marker genesSox-2 andOct-4 were examined by real-time PCR during the transformation of SW620 to spheres from 1 d to 7 d.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsserum-free medium on day 2;△P<0.05vsserum-free medium on day 3.

圖1 無血清培養方法得到SW620細胞球高表達胚胎干細胞表面標志物及干細胞相關基因

2 SW620細胞系來源的細胞球細胞克隆形成能力和成瘤性顯著增加，并對化療藥抗拒

在倒置顯微鏡下對2組細胞所生成的細胞克隆進行觀察、計數。結果顯示，無血清條件培養下的SW620細胞球消化成單個細胞克隆形成率是(4.44±3.85)%，含10%血清的DMEM/F12培養液培養的SW620細胞克隆形成率為(0.89±0.38)%，兩者的克隆形成率差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2A。接種2×103個細胞球細胞組中，2只裸鼠4周后皮下可觀察到直徑3 mm左右隆起，而貼壁細胞組無一只形成皮下隆起；接種2×104個細胞球細胞組中，2只裸鼠4周后形成皮下移植瘤。而貼壁細胞至少需要2×105個細胞才能形成皮下移植瘤。同樣以2×105個細胞接種的情況下，細胞球細胞形成的移植瘤體積為(2 279±346.3)mm3，而SW620貼壁細胞形成的移植瘤體積為(889.8±78.8)mm3(P<0.05)。細胞球細胞具有更強的體內成瘤能力，見圖2B。隨著濃度的遞增，5-FU和mitomycin C對SW620貼壁細胞及細胞球細胞的抑制作用逐漸增強，但細胞球細胞對2種化療藥物的作用較貼壁細胞明顯抗拒，見圖2C。這些具備干細胞特性的細胞即為SW620 CSCLC。

Figure 2.SW620-derived spheroid cells exhibited greater abilities of clonogenicity and tumorigenicity. A: colony formation in soft agar medium was photographed 3 d, 8 d and 10 d after seeding. The spheroid cells had higher colony formation efficiency as compared to the adherent SW620 cells. B: sorted cells were subcutaneously injected into the dorsal regions of nude mice at a dose of 2×105cells. Spheroid cells produced palpable xenograft tumors at the injection site, while adherent cells didn’t generate tumors. C: 5-FU- or mitomycin C-induced growth inhibition was compared between adherent cells and spheroid cells. Spheroid cells showed higher resistance to both chemotherapeutic drugs compared with adherent cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsadherent cells.

圖2 SW620細胞系來源的細胞球細胞克隆形成能力和成瘤性顯著增加，并抗化療藥

3 n-3 PUFAs抑制SW620 CSCLC的增殖

隨著DHA、EPA、DHA+EPA濃度從10 μmol/L增加至70 μmol/L，DHA、EPA或2種n-3 PUFAs聯合對SW620 CSCLC及貼壁細胞的抑制作用呈增強趨勢。結果顯示，各濃度n-3 PUFAs對CSCLC的抑制作用以聯合組最強，單用DHA組居中，單用EPA組最弱，各組之間差異有統計學意義(P<0.05)。流式細胞術檢測Annexin V/PI染色凋亡細胞以及臺盼藍染色死亡細胞計數進一步支持MTS生長抑制實驗的結果，即各濃度n-3 PUFAs誘導CSCLC凋亡及促進細胞死亡的作用以聯合組最強，單用DHA組居中，單用EPA組最弱，各組之間差異具有統計學意義(P<0.05)。n-3 PUFAs對貼壁細胞同樣具有抑制作用，見圖3。

Figure 3.n-3 PUFAs induced apoptotic cell death in both spheroid cells and adherent cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsEPA alone;△P<0.05vsDHA alone.

圖3 n-3 PUFAs對SW620 CSCLC增殖的影響

4 n-3 PUFAs增加SW620 CSCLC對化學治療藥物的敏感性

隨著濃度的遞增，5-FU及mitomycin C對SW620 CSCLC的生長抑制作用呈現濃度依賴性。2種化療藥物聯合EPA(50 μmol/L)或DHA(50 μmol/L)，或聯合EPA(50 μmol/L)+DHA(50 μmol/L)均較單用化療藥物時對SW620 CSCLC的生長抑制作用增強，該增強作用在聯合2種n-3 PUFAs時最為有效。DHA增強化療藥物抑制SW620 CSCLC的作用顯著高于EPA，見圖4。

討 論

Hierarchy學說認為腫瘤組織中存在極少數具有無限增殖和自我更新能力、能夠導致腫瘤發生的細胞，即“腫瘤干細胞”，它是腫瘤轉移、復發及耐藥的根源[11]。關于CRC，近年的研究也發現了CSC的存在[3]，然而，缺乏公認的結直腸CSC的特異性標志物以及難以獲取大量結直腸CSC作為研究對象，影響了人們對結直腸CSC的深入研究。為了解決CSC來源問題，本研究率先進行了包括無血清培養等一系列嘗試，并成功從SW620細胞系中培養、穩定傳代了具有干細胞特性的細胞，稱之為CRC的CSCLC。

實驗伊始，我們收集了23例CRC患者原代腫瘤組織，希望通過體外培養獲得原代CRC細胞，以便進一步分離、純化腫瘤干細胞。然而，在對這些原代腫瘤組織進行培養的過程中，屢屢遭遇的污染問題曾一度使實驗陷于困境。通過不斷總結經驗，克服污染后，培養出來的細胞成分復雜，難以去除大量的成纖維細胞，以致所能獲得的腫瘤細胞數量稀少，無法連續傳代，無法從患者的原代組織中培養出CRC的CSCLC。

以上實驗的失敗讓我們不得不考慮從其它途徑獲取結直腸CSC。有報道指出，一些哺乳動物的成體干細胞能夠在無血清培養基內呈非黏附性球形生長，而大多數已分化的腫瘤細胞由于不能貼壁而發生失巢凋亡，而存活下來的則是一些增殖力強、類似于干細胞樣的腫瘤細胞[12]。因此，無血清培養法成為一種有效富集腫瘤干細胞的方法[13]。本實驗用無血清培養法培養出SW620細胞球，并且實現在體外的大量繁殖和穩定傳代，實驗結束時，此細胞球已穩定傳至12代，且其干細胞特性并未發生改變。

Figure 4.n-3 PUFAs increased chemosensitivities of SW620 CSCLC to 5-FU and mitomycin C (Mit C). When 5-FU (A) or Mit C (B) were combined with DHA(50 μmol/L), EPA(50 μmol/L), or DHA plus EPA, the therapeutic effects of the chemotherapeutics increased in a dose-dependent manner. The combination of chemodrugs with DHA plus EPA had greater effect than DHA or EPA alone. EPA alone had the weakest effect on chemosensitivity. Mean±SD.n=3.

圖4 n-3 PUFAs增加SW620 CSCLC對化學治療藥物的敏感性

對n-3 PUFAs重要性的認識緣于20世紀80年代對愛斯基摩人心血管發病率降低與經常食用深海魚類有關這一發現。近年來，大量流行病學調查結果提示n-3 PUFAs能預防腫瘤發生、抑制腫瘤生長。已知n-3 PUFAs對CRC的抑制作用主要表現為抑制細胞增殖、遷移，誘導其分化、凋亡和改善患者腫瘤體質等[14]。本研究提出如下假設，n-3 PUFAs亦可以抑制結直腸CSCLC的生長、誘導其凋亡。本研究結果發現，EPA及DHA不僅能夠抑制SW620 CSCLC的生長，促使其凋亡，而且能夠增強化療藥物抗CSCLC的效果。盡管此前一些動物學實驗結果支持在化療前和化療過程中使用n-3 PUFAs能夠起到良好的增敏作用，但其機制尚不明確。目前認為n-3 PUFAs可能通過以下機制參與調節腫瘤細胞的化療敏感性：(1)改變腫瘤細胞生物膜的結構和功能[15]；(2)增強脂質過氧化作用[16]；(3)影響化療藥物的吸收[17]；(4)影響核苷類似物的代謝[18]；(5)抑制腫瘤血管生成[19]。以上所述機制均為在腫瘤細胞中的研究結果。n-3 PUFAs是否通過相同的機制與化療藥物協同，發揮抑制CSC的作用，將是我們下一步研究的方向。雖然n-3 PUFAs能夠與化療藥物協同抗腫瘤這一點尚未得到大規模臨床試驗的支持，但n-3 PUFAs良好的預防和治療潛力已收到廣泛關注。相信隨著研究的不斷深入，n-3 PUFAs在未來腫瘤防治中可能作為標準化療的有效佐劑而擁有更廣闊的應用前景[20]。

綜上所述，我們用無血清培養法能成功從SW620細胞中分離出CSCLC。它們具有高克隆形成能力及高致瘤性，對化療藥物相對抗拒。DHA和EPA能夠抑制SW620來源CSCLC的生長、促使其發生凋亡，并且能夠增加SW620 CSCLC對5-FU或mitomycin C的敏感性。

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Cultivation and identification of human colon cancer stem cell-like cells and antiproliferative effects of n-3 polyunsaturated fatty acids

FANG Shi1, LONG Jian-ting2, ZHANG Bing3, YANG Ting4, LU Wei1, LI He-ping2, SHI Han-ping5

(1DepartmentofClinicNutrition,2DepartmentofMedicinalOncology,3DepartmentofNuclearMedicine,5DepartmentofSurgery,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;4IntensiveCareUnit,ZhongshanPeople’sHospital,Zhongshan528400,China.E-mail:yangting_1234@aliyun.com)

AIM: To cultivate stem-like spheres from SW620 cell line in the specific serum-free medium and evaluate the features of the cancer stem cells, and to investigate the effects of docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA) on the growth of SW620 stem cell-like cells. METHODS: Human colon cancer stem cell-like cells (CSCLC) were obtained from SW620 spheres cultured in serum-free medium. These cells were tested for the expression of SSEA-1 and TRA-1-81 by immunofluorescence staining. The mRNA expression of Sox-2 and Oct-4 was detected by real-time PCR. The efficiency of colony formation on a soft agar gel and tumor formation in the nude mice was compared between SW620 adherent cells and CSCLC. The inhibitory effects of 5-fluorouracil (5-FU) and mitomycin C on both types of cells were measured by MTS assay. MTS assay, Annexin V/PI staining and trypan blue staining were used to determine the effects of DHA and EPA on both types of cells. MTS assay was also used to analyze the combined effect of DHA or EPA with chemotherapeutic drugs on SW620 CSCLC. RESULTS: SW620 cells formed spheres in serum-free culture. The cells from spheres highly expressed SSEA-1 and TRA-1-81, transiently expressedSox-2 andOct-4 genes and were more resistant to 5-FU and mitomycin C treatments. These cells exhibited a greater ability in clone formation and tumorigenicity, indicating that these cells carried stem cell-like features, hence were considered SW620-derived CSCLC. DHA and/or EPA suppressed SW620 CSCLC by inhibiting cell growth, inducing cell apoptosis and sensitizing them to chemotherapeutic drugs. CONCLUSION: The cells with stem cell-like features, such as high efficiency in clonogenicity, tumorigenicity and resistance to chemotherapeutic drugs, can be obtained from SW620 spheres cultured in serum-free condition. DHA and EPA induce apoptosis in SW620-derived CSCLC and sensitize them to chemotherapeutic drugs.

Colonic neoplasms; Neoplastic stem cells; Serum-free culture; n-3 Polyunsaturated fatty acids; Chemotherapy

1000- 4718(2014)12- 2135- 07

2014- 06- 09

2014- 10- 24

國家“十一·五”科技支撐計劃(No. 2008BAD91B03)； 廣東省科技計劃社會發展項目(No. 2013B021800284)； 廣東省教育部產學研結合項目(No. 2011B090400558)

R735.34

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.004

△通訊作者 Tel： 020-87755766-8179; E-mail: yangting_1234@aliyun.com