丹參酮IIA對低氧條件下人肝癌HepG2細胞增殖、凋亡的影響及與HIF-1α、VEGF和野生型P53蛋白表達的關系*

劉麗璇， 吳靈飛， 鄧 巍， 周小濤， 陳銳沛， 項夢琦， 郭益添， 蒲澤錦， 李國平

(汕頭大學醫學院第二附屬醫院消化內科，廣東 汕頭 515041)

丹參酮IIA對低氧條件下人肝癌HepG2細胞增殖、凋亡的影響及與HIF-1α、VEGF和野生型P53蛋白表達的關系*

劉麗璇， 吳靈飛， 鄧 巍， 周小濤， 陳銳沛， 項夢琦， 郭益添， 蒲澤錦， 李國平△

(汕頭大學醫學院第二附屬醫院消化內科，廣東 汕頭 515041)

目的： 探討低氧條件下丹參酮IIA(Tan IIA)對人肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的影響及其分子機制。方法: 用氯化鈷(CoCl2)創建低氧模型，實驗分為常氧對照組、低氧對照組和低氧+Tan IIA處理組。不同濃度的Tan IIA 分別作用于低氧下人肝癌HepG2細胞24 h、48 h和72 h，采用MTT法測定Tan IIA 對低氧下HepG2細胞增殖的抑制作用。不同濃度的Tan IIA 分別作用于低氧條件下HepG2細胞24 h和48 h后，Hoechst 33258染色法檢測細胞核的形態學變化并計算凋亡率。不同濃度的Tan IIA 作用于低氧條件下人肝癌HepG2細胞48 h后，Western blotting檢測低氧誘導因子1α (HIF-1α)、血管內皮生長因子(VEGF)和野生型P53的蛋白表達情況。結果: 低氧條件下Tan IIA以時間和劑量依賴方式抑制HepG2細胞的生長和增殖。Tan IIA 作用于低氧下的HepG2細胞后，可見典型的凋亡細胞形態學特征，細胞凋亡率呈時間、劑量依賴性的增加。Western blotting免疫印跡法顯示常氧對照組的HIF-1α和VEGF表達較低，而低氧對照組的HIF-1α、VEGF蛋白表達較常氧組升高，低氧下隨著Tan IIA 濃度的升高，HIF-1α和VEGF蛋白的表達明顯降低，野生型P53蛋白的表達隨著Tan IIA 濃度的升高而升高。結論: 低氧條件下，Tan IIA能抑制肝癌HepG2細胞增殖并誘導其凋亡，其機制可能與抑制HIF-1α和VEGF蛋白表達，上調P53蛋白表達有關。

丹參酮IIA； 低氧； HepG2細胞； 細胞凋亡

肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是臨床上常見的惡性腫瘤，HCC使得全球每年大約有662 000例死亡，其中一半發生在中國[1]。HCC為血供豐富的實體惡性腫瘤，但由于腫瘤快速生長而血管生長卻相對滯后，致使耗氧量超過了微血管所能提供的氧量，因此肝癌組織內細胞長期處于相對缺氧的微環境[2]。低氧微環境使腫瘤細胞發生一系列適應性變化，如促進腫瘤血管生成、增強無氧糖酵解和凋亡耐受等，而低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha, HIF-1α)是腫瘤低氧應答的關鍵因子，HIF-1α與腫瘤血管生成、化療抵抗、無氧糖酵解及惡性演進、侵襲轉移等密切相關[3]。因此，尋找低氧條件下仍然有效的抗腫瘤藥物成為目前研究的重要課題。丹參是臨床上常用的活血化瘀的中藥，丹參酮IIA(tanshinone IIA，Tan IIA)是其主要成分之一，目前發現Tan IIA對包括肝癌HepG2細胞在內的多種腫瘤細胞具有抑制增殖、誘導凋亡、抑制腫瘤血管形成和轉移等抗癌活性[4-5]。但目前有關低氧條件下Tan IIA對肝癌HepG2細胞增殖及凋亡的影響還不明確。本研究采用MTT法、Hoechst 33258染色法和免疫印跡法研究Tan IIA對低氧模擬培養的、表達野生型P53的人肝癌HepG2細胞增殖抑制、凋亡的影響及與HIF-1α、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和P53蛋白表達的相互關系。

材 料 和 方 法

1 材料

人肝癌HepG2細胞由本實驗室保存；丹參酮IIA(Tan IIA)購自中國藥品生物制品檢定所，用二甲亞砜(DMSO)溶解，分裝后于-20 ℃冰箱保存備用；MTT購于Amersco；DMEM培養基和胎牛血清購于Gibco；兔抗人多克隆抗體HIF-1α、兔抗人多克隆抗體VEGF為Santa Cruz產品；鼠抗人單克隆抗體P53、兔抗人多克隆抗體α-tubulin為北京中杉金橋產品；Hoechst 33258熒光染色試劑及氯化鈷(CoCl2)、山羊抗兔多克隆Ⅱ抗、山羊抗鼠多克隆Ⅱ抗、蛋白酶抑制劑PMSF和裂解液RIPA均購自Sigma；其它試劑均為國產分析純。

2 主要方法

2.1 細胞培養 人肝癌HepG2細胞常規培養于高糖型DMEM培養基中(含10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各1×105U/L)，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度環境的恒溫培養箱培養， 細胞呈單層貼壁生長，長滿80%左右時，以0.25%胰酶-EDTA消化傳代，所有實驗均在細胞對數生長期進行。化學缺氧劑CoCl2加入培養液的終濃度為150 μmol/L，用于模擬低氧微環境。

2.2 MTT實驗測定細胞抑制率 取對數生長期的HepG2細胞，細胞密度調整為2.5×107/L，接種于96孔板，每孔200 μL，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下的培養箱培養24 h后棄去培養基，實驗分3組：常氧對照組、低氧對照組和低氧+Tan IIA處理組。待細胞貼壁后分別加入CoCl2和不同濃度的Tan IIA(0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L)，每孔總體積200 μL，每個濃度組設5個復孔，四周加入不含藥物的細胞培養液為空白對照。分別繼續培養24 h、48 h、72 h后每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續孵育4 h，吸盡上清液，每孔加入DMSO 150 μL，避光振蕩10 min，以DMSO調零，在酶聯免疫檢測儀以570 nm 波長測定各孔吸光度(A)，計算5孔的平均值和增殖抑制率：增殖抑制率(%) =(常氧對照組A-低氧對照組或低氧處理組A)/常氧對照組A×100%。

2.3 Hoechst 33258染色觀察凋亡細胞形態學變化及計算凋亡率 取對數生長期的HepG2細胞制成2.5×107/L的細胞懸液，接種于放有蓋玻片的24孔板內，每孔0.5 mL，分組同前，待細胞貼壁后分別加入CoCl2和不同濃度Tan IIA (1.0、2.0、5.0 mg/L) 培養24 h或48 h后吸盡培養液，取出蓋玻片，甲醇/冰醋酸固定液固定5 min后加入熒光染液Hoechst 33258重懸細胞，室溫避光1 h，PBS沖洗，用抗熒光液封片。顯微鏡下觀察，正常細胞核為藍色，凋亡的細胞核為白色。每片連續觀察10個細胞分布均勻的200倍鏡視野，每視野計數50個細胞，共500個細胞，計算其陽性率百分數，并取其均值。凋亡率(%)=凋亡細胞數/(正常細胞數+凋亡細胞數)×100%。

2.4 Western blotting免疫印跡法測定蛋白表達情況 將對數生長期的HepG2細胞制成2.5×107/L的細胞懸液，接種于6孔板中，每孔2 mL，分組同前，待細胞貼壁后分別加入CoCl2和不同濃度Tan IIA (1.0、2.0、5.0 mg/L)，培養48 h后收集細胞，分別加入適量含PMSF的RIPA裂解液，于冰上裂解30 min，4 ℃下12 000×g離心 10 min，取上清用BCA法檢測蛋白濃度。用8%～12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉至NC膜上。5%～10%脫脂牛奶室溫封閉非特異抗原1 h，然后分別加入兔抗人HIF-1α多克隆抗體(1∶200)、兔抗人VEGF多克隆抗體(1∶200)和鼠抗人P53單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜， 接著加入山羊抗兔(1∶3 000)、山羊抗鼠(1∶3 000)Ⅱ抗室溫孵育1 h。用ECL法發光，于暗室曝光，Quantity one進行半定量分析。

3 統計學處理

實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學處理，組間均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P< 0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Tan IIA 對低氧條件下的HepG2細胞增殖抑制

為了研究Tan IIA對低氧下條件HepG2細胞增殖的影響，我們做了MTT細胞活力測定實驗，結果如圖1顯示。低氧條件下HepG2肝癌細胞的增殖受抑制, 并呈時間依賴性；而Tan IIA則可呈劑量和時間依賴性地進一步抑制低氧條件下HepG2肝癌細胞的增殖。

Figure 1.The inhibitory effect of Tan IIA on the proliferation of HepG2 cells under hypoxia detected by MTT assay. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsnormoxia;#P<0.05vshypoxia.

圖1 Tan IIA 對低氧條件下的HepG2細胞增殖活性的影響

2 Tan IIA 在低氧條件下誘導HepG2細胞凋亡

根據上述實驗結果，為了進一步證實Tan IIA抑制HepG2細胞增殖是通過促進其凋亡作用，我們用Hoechst 33258分別對常氧對照組、低氧對照組和在低氧條件下經不同濃度Tan IIA(1.0、2.0、5.0 mg/L)處理24 h或48 h的細胞核進行染色，觀察細胞核的形態學改變。在熒光顯微鏡下，正常細胞的細胞核呈彌散均勻藍色熒光，而凋亡細胞核固縮，碎裂，分解，呈現濃染致密的顆粒塊狀白色熒光，出現了典型的凋亡性細胞核改變，并隨著Tan IIA濃度的升高和作用時間的延長，凋亡細胞的比例逐漸增高，見圖2。我們計算了凋亡率，低氧條件下Tan IIA誘導HepG2細胞凋亡率呈現劑量和時間依賴性(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.The effects of Tan IIA treatment for 24 h or 48 h on the apoptosis of HepG2 cells under hypoxia (Hoechst 33258 staining，×200).A: normoxia; B: hypoxia; C: hypoxia+1 mg/L Tan IIA; D: hypoxia+2 mg/L Tan IIA; E: hypoxia+5 mg/L Tan IIA.

圖2 Hoechst 33258染色法觀察低氧條件下Tan IIA處理HepG2細胞24 h 或48 h后的凋亡情況

Figure 3.The apoptosis rate of HepG2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormoxia;#P<0.05vshypoxia.

圖3 Tan IIA 干預對低氧條件下HepG2細胞凋亡率的影響

3 Tan IIA 在低氧條件下對HepG2細胞HIF-1α、VEGF和野生型P53蛋白表達的影響

圖4結果表明，常氧對照組HIF-1α和VEGF表

達較低，而低氧對照組(48 h)HIF-1α和VEGF的蛋白表達較常氧對照組升高，低氧條件下Tan IIA 處理組(48 h)的HIF-1α和VEGF蛋白表達隨著Tan IIA 濃度的升高而降低(P<0.05)，野生型P53的表達隨著Tan IIA 濃度的升高而升高(P<0.05)，差異均有統計學意義，并呈現量效關系。

討 論

低氧微環境是多種實體腫瘤包括肝癌在內的共同特征，在缺氧條件下，腫瘤細胞為了繼續生長而啟動了一系列反應，包括了HIF-1的相關基因的表達[2-3]。HIF-1屬于低氧誘導因子蛋白家族，該家族有HIF-1、HIF-2和HIF-3 共3個成員組成，由α亞基(HIF-1α、HIF-2α及HIF-3α)和β亞基構成異源二聚體，組成HIF的2個亞基。由于α亞基受氧濃度調節，β亞基在細胞中穩定存在不受氧濃度的調節，所以HIF-1的調控主要在于α亞基。常氧條件下，HIF-1α氧依賴降解結構域(oxygen-dependent degradation domain，ODD)特殊的脯氨酸殘基被羥基化，使α亞基形成β折疊樣構象，然后與林希氏(von Hippel-Lindau,VHL)蛋白結合，經泛素-蛋白酶體途徑被降解[6]。低氧時由于降解途徑被抑制，HIF-1α在細胞內聚集，并轉位到細胞核內與HIF-1β結合成HIF-1，并啟動下游基因(如VEGF)的轉錄，增加了相應的蛋白質產物。這些產物在腫瘤細胞的放療和化療耐藥性中有著重要的作用[7]。

Figure 4.The effects of Tan IIA treatment on protein expression of HIF-1α, VEGF and wild-type P53 in HepG2 cells under hypoxia for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormoxia；#P<0.05vshypoxia.

圖4 Tan IIA對低氧條件下HepG2細胞HIF-1α、VEGF和野生型P53蛋白表達的影響

丹參酮是中藥丹參根的乙醇或乙醚提取物，其中含有15種成分，具有抗感染、抗心血管病、抗炎和調節免疫應答等作用。作為丹參的主要有效提取成分，Tan IIA在常氧條件下對HepG2細胞的生長有抑制作用，具有時間和濃度依賴性，并能誘導其凋亡[4-5]。本實驗我們主要觀察了低氧條件下Tan IIA對HepG2細胞的增殖和凋亡的影響以及與HIF-1α、VEGF和P53蛋白表達的關系。MTT實驗發現，低氧下Tan IIA可呈劑量和時間依賴性地抑制HepG2細胞的增殖，10 mg/L作用于低氧下的HepG2細胞72 h，抑制率達到78.8%，但與48 h組比，差異沒有統計學意義，這可能與Tan IIA的藥代動力學特點有關。Tan IIA是短半衰期藥物，其體內消除半衰期僅為2.25 h，即Tan IIA在體內經過5個消除半衰期(約57.7 h)可基本消除[8]。由此，我們在接下來的Hoechst 33258染核實驗中只選取了24 h和48 h來觀察低氧條件下Tan IIA對HepG2細胞凋亡的影響，結果證明隨著Tan IIA濃度的升高和作用時間的延長，細胞凋亡率逐漸增高，5 mg/L作用于低氧下的HepG2細胞48 h，凋亡率為26.45%。Western blotting法發現，低氧條件下HepG2細胞的HIF-1α和VEGF的表達增強，這與文獻報道相符[9]，且Tan IIA能劑量依賴性抑制二者表達。研究表明，低氧誘導HIF-1α表達使腫瘤細胞耐受凋亡，而Tan IIA在低氧條件下能通過下調乳腺癌MCF-7和HCC1973細胞的HIF-1α表達來逆轉阿霉素耐藥[10]。趙志成等[11]證實表沒食子兒茶素沒食子酸酯可明顯抑制缺氧處理的肝癌HepG2細胞的增殖，干預HIF-1α/VEGF信號轉導通路可能是其抑制腫瘤生長的主要機制之一。腫瘤的生長、侵襲、轉移與腫瘤的新生血管密切相關，VEGF是目前已知作用最強的血管生成誘導因子，其增強子區域存在數個轉錄因子結合位點，如AP-1、AP-2、SP-1和HIF-1。常氧條件下VEGF的表達主要由SP-1蛋白調節，但在缺氧條件下，細胞內AP-1、 AP-2和SP-1蛋白水平改變不明顯，而HIF-1大量表達，HIF-1可增加VEGF基因轉錄，并使VEGF mRNA穩定性增加，VEGF受體表達上調，使VEGF的生物學效應增強[7]。VEGF有抑制腫瘤細胞的凋亡作用，例如VEGF可誘導抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，直接抑制腫瘤細胞的凋亡，同時增強腫瘤細胞對放療的耐受性。肝癌是典型的高血管腫瘤，理論上通過抑制VEGF對抗腫瘤意義重大[12]。因此，我們推測Tan IIA在缺氧時可能通過抑制HIF-1表達進而抑制VEGF發揮其抗腫瘤作用。

我們的研究證實，低氧條件下Tan IIA作用于HepG2細胞后劑量依賴性抑制HIF-1α和VEGF的表達的同時上調P53蛋白表達，這可能與發生了P53相關的凋亡有關。腫瘤細胞的凋亡有P53依賴性和非P53依賴性2條途徑，而低氧條件下的凋亡可能是通過HIF-1α為中介的P53依賴性途徑起作用[13]。正常情況下，野生型P53在細胞中呈現低水平表達，因為MDM-2可通過反饋環對P53的功能進行調節，即MDM-2通過泛素化與P53結合而抑制P53的轉錄活性[14]。在低氧情況下可通過HIF-1α通路誘導P53的表達，并能通過與P53蛋白競爭與MDM2結合，防止P53被MDM2途徑降解，從而引起P53途徑的活化，促進P53依賴的細胞凋亡，而野生型P53也對HIF-1α進行調節，一是通過MDM2介導的泛素-蛋白酶解通路促進HIF-1α蛋白的降解，二是和HIF-1α競爭與CBP/p300結合，抑制HIF-1α的轉錄激活活性從而降低HIF-1α蛋白的表達[14]。 P53與VEGF之間也有明顯的相關性，野生型P53能參與下調內源性VEGF mRNA水平及VEGF啟動子的活性[15]。研究證實，姜黃素可誘導細胞內P53的聚集，促進泛素-蛋白酶體對HIF-1α蛋白的降解，從而抑制HIF-1α的穩定性，繼而下調HIF-1靶基因VEGF的表達[16]。

總之，本研究結果表明Tan IIA在低氧條件下可抑制HepG2肝癌細胞增殖，促進細胞凋亡。我們推測，低氧條件下Tan IIA對HepG2細胞的殺傷機制有可能是Tan IIA通過蛋白酶體途徑使低氧誘導的HepG2細胞中的HIF-1α降解和失活，繼而下調HIF-1下游基因VEGF的表達，從而抑制腫瘤血管生成，延緩腫瘤生長，同時發生與P53通路相關的凋亡，但具體的細胞信號通路有待進一步研究。

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Effects of tanshinone IIA on proliferation, apoptosis and expression of HIF-1α, VEGF and wild-type P53 in human hepatoma HepG2 cells under hypoxia

LIU Li-xuan, WU Ling-fei, DENG Wei, ZHOU Xiao-tao, CHEN Rui-pei, XIANG Meng-qi, GUO Yi-tian, PU Ze-jin, LI Guo-ping

(DepartmentofGastroenterology,TheSecondAffiliatedHospitalofShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041,China.E-mail:guopingli8@163.com)

AIM: To investigate the effects of tanshinone IIA (Tan IIA) on proliferation, apoptosis and its molecular mechanism in human hepatoma HepG2 cells under hypoxic condition. METHODS: Hypoxia model was established by treatment with cobalt chloride (CoCl2). The cells were divided into normoxia control group, hypoxia control group and hypoxia combined at different concentrations of Tan IIA groups. After HepG2 cells were incubated with different concentrations of Tan IIA (0.5, 1.0, 2.0, 5.0 and 10.0 mg/L) for 24 h, 48 h and 72 h under hypoxic condition, the cell proliferation was determined by MTT assay. After Tan IIA was added to the media at different concentrations for 24 h and 48 h, the apoptotic cells were observed by Hoechst 33258 staining. The protein levels of hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1α), vascular endothelial growth factor (VEGF) and wild-type P53 were detected by Western blotting after cultured with different concentrations of Tan IIA for 48 h. RESULTS: Tan IIA inhibited the proliferation of HepG2 cells in a dose- and time-dependent manner. Tan IIA induced the typical morphology of apoptotic cells and increased the apoptotic rate in a dose- and time-dependent manner after treatment with 1.0 mg/L～5.0 mg/L for 24 h and 48 h under hypoxic condition. The protein levels of HIF-1α and VEGF were weakly expressed in HepG2 cells under normoxia but up-regulated after incubated under hypoxia for 48 h. The protein expression of HIF-1α and VEGF were decreased with the increase in the concentration of Tan IIA under hypoxia. The protein expression of wild-type P53 was increased with the increase in the concentrations of Tan IIA under hypoxia. CONCLUSION: Tan IIA significantly inhibits the proliferation and induces the apoptosis of human hepatoma HepG2 cells under hypoxia, which may be related to the down-regulation of HIF-1α and VEGF and up-regulation of wild-type P53.

Tanshinone IIA; Hypoxia; HepG2 cells; Apoptosis

1000- 4718(2014)12- 2155- 06

2014- 06- 20

2014- 08- 14

廣東省中醫藥局資助項目(No.20121165)

R285.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.007

△通訊作者 Tel：0754-88915604；E-mail: guopingli8@163.com