過表達腦紅蛋白通過激活PI3K/Akt信號通路防治AD的體外研究*

楊 軍， 戴頌陽， 向 月， 張 雄

(重慶醫科大學神經科學研究中心，重慶市神經生物學重點實驗室，重慶 400016)

過表達腦紅蛋白通過激活PI3K/Akt信號通路防治AD的體外研究*

楊 軍， 戴頌陽， 向 月， 張 雄△

(重慶醫科大學神經科學研究中心，重慶市神經生物學重點實驗室，重慶 400016)

目的： 探索過表達腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)對轉染了pAPPswe的SH-SY5Y細胞的神經保護作用及機制。方法: 成功構建過表達NGB的質粒pEGFP-NGB并轉染入已預先轉染了pAPPswe的SH-SY5Y細胞，MTT法檢測過表達NGB對該細胞存活率的影響；JC-1法檢測其對細胞線粒體膜電位的影響；流式細胞術檢測過表達NGB對細胞凋亡的影響；Western blotting法檢測其對細胞中p-Akt、 Akt和caspase-3/9表達的影響；ELISA法檢測其對細胞內Aβ42生成的影響。結果: MTT結果顯示，與對照組和空質粒組比較，轉染NGB后，pAPPswe-SH-SY5Y細胞的存活率明顯提高，差異有統計學意義(P<0.05)。JC-1染色結果顯示過表達NGB能夠明顯抑制轉染pAPPswe對SH-SY5Y細胞線粒體膜電位的降低作用(P<0.05)。流式細胞術結果顯示過表達NGB能夠抑制早、晚期細胞的凋亡。而Western blotting顯示過表達NGB不僅能抑制細胞內caspase-3和caspase-9蛋白水平的表達，而且還能夠促進細胞內p-Akt蛋白的表達，而這種促進作用能夠被PI3K/Akt的抑制劑LY294002所抑制。ELISA結果顯示過表達NGB能夠明顯抑制細胞內Aβ42的生成。結論: 過表達NGB能夠顯著抑制pAPPswe誘導的細胞損傷，而且還抑制與細胞凋亡密切相關的caspase-3和caspase-9等蛋白表達。NGB的神經保護作用可能是通過激活PI3K/Akt信號通路來實現的。

腦紅蛋白； SH-SY5Y細胞； 細胞凋亡； Caspase-3/9； PI3K/Akt信號通路

眾所周知，神經元的丟失是阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的主要的病理特征之一，而神經元丟失的主要表現為神經元的凋亡[1]。盡管，AD中神經元凋亡的機制仍舊不清，但多數學者認為β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein, Aβ)在腦組織中的積聚是各種原因誘發AD的共同通路，也是誘發神經元凋亡并導致AD認知功能障礙關鍵因素[2]。因此，如何抑制Aβ的產生以及降低Aβ誘導的神經元的凋亡可能成為防治AD的重要策略[3]。腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)是一種廣泛存在于腦內的新型攜氧球蛋白，由德國科學家Burmester等[4]于2000年發現。該蛋白具有廣泛的內源性腦保護功能：不僅對由于缺血、缺氧引起的腦損傷有保護功能(如腦卒中)[5]，而且對非缺血缺氧性的腦損傷也有保護功能(如神經系統變性疾病AD)[6]。但具體的保護調控機制目前尚不清楚。本實驗以pAPPswe轉染SH-SY5Y細胞建立AD模型，觀察過表達NGB對細胞的神經保護作用，并探討其分子調控機制，為治療AD提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 細胞及質粒

神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞由重慶醫科大學病理生理教研室湯為學教授惠贈；pAPPswe質粒由重慶醫科大學附屬兒童醫院宋偉宏教授惠贈；pEGFP-NGB質粒以及空質粒均由上海吉凱公司提供。NGB基因片段序列為：5’-TCC GCT CGA GCT ATG GAG CGC CCG GAG CCC GA-3’; 5’-ATC GGG ATC CTT ACT CGC CAT CCC AGC CTC GA-3’。

2 主要試劑

DMEM高糖培養基、胎牛血清和胰蛋白酶購自HyClone；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒、MTT和SDS-PAGE凝膠配置試劑盒和青霉素-鏈霉素雙抗購自碧云天生物技術研究所；PRO-PREPTM蛋白提取液購自北京賽百盛基因技術有限公司；PVDF膜購自Millipore；PageRulerTMPrestained Protein Ladder購自 Fermentas；多克隆兔抗人caspase-3和caspase-9抗體購自Bioworld；單克隆兔抗人Akt和p-Akt抗體和HRP標記的山羊抗兔IgG均購自北京博奧森生物技術有限公司；Lipo2000購自Invitrogen；ECL發光試劑盒購自Bio-Rad；免疫組化試劑盒購自北京康為世紀生物技術有限公司；ELISA試劑盒購自Biosourse。

3 主要實驗方法

3.1 細胞培養 將凍存的SH-SY5Y細胞37 ℃復蘇至培養瓶中，用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養液，置37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。

3.2 pEGFP-NGB細胞轉染 當已經轉染了pAPPswe的SH-SY5Y細胞單層融合率達85%以上時，棄培養液，取8 μg 質粒pEGFP-NGB加入0.75 mL無抗生素無血清的DMEM培養液中混勻；取30 μL Lipo2000加入0.75 mL無抗生素無血清的DMEM培養液中混勻，室溫靜置5 min；再將兩管液體輕混，室溫靜置20 min后加入含7.5 mL無抗生素無血清的DMEM培養液中，繼續培養6～8 h后，更換正常細胞所需DMEM培養液，繼續孵育24 h[7]。

3.3 MTT法檢測細胞存活率 將SH-SY5Y細胞稀釋至1×107/L，然后按每孔500 μL體積的細胞懸液接種于96孔板中，分為對照組(已轉染pAPPswe)、轉染空質粒組(vector組)及轉染pEGFP-NGB組(pNGB組)。待細胞貼壁24 h后，向各孔中分別加入50 μL MTT，于37 ℃培養箱中溫育4 h。棄去各孔中的DMEM培養基和MTT，在所有孔中各加入200 μL DMSO，振蕩混勻后，用酶標儀在490 nm波長處檢測其吸光度(A490)。按下式計算細胞存活率。

細胞存活率(%)= 實驗組A490值/對照組A490值×100%。

3.4 線粒體膜電位的檢測 采用JC-1法。實驗分組同MTT法，加入JC-1染料共同孵育30 min，PBS洗滌細胞3次，收集細胞，采用ND-1000熒光分光光度計檢測JC-1單體時，激發光設置為490 nm，發射光設置為530 nm；檢測JC-1聚合物時，激發光設置為525 nm，發射光設置為590 nm，激發波長為485 nm。所有的數值均以590 nm處(紅光)的吸光度/530 nm處(綠光)的吸光度表示,即用紅綠熒光的比值來衡量線粒體去極化的比例。

3.5 流式細胞儀檢測 1×107/L的轉染pAPPswe的SH-SY5Y細胞接種于6孔板，經過不同處理后，用預冷的PBS液沖洗細胞2遍，加入Annexin V-FITC和PI的混合液，置于室溫、避光環境下孵育15 min，最后用流式細胞儀檢測。

3.6 Western blotting 分別收集對照組、空質粒轉染組、pNGB組以及pNGB+LY294002組的細胞，加入100 μL蛋白裂解液，-20 ℃放置20 min，13 000 r/min離心5 min，收集上清，Bradford法檢測蛋白濃度。8%～12%的SDS-PAGE分離后，轉移至PVDF膜上，以含0.5 g/L脫脂奶粉TBST液室溫封閉1 h，加入兔抗人caspase-3(1∶250)、caspase-9抗體(1∶ 250)、Akt(1∶500)、p-Akt(1∶500)和β-actin抗體(1∶ 5 000)，4 ℃孵育過夜；用TBST洗滌3次，加入HRP標記的羊抗兔IgG(1∶5 000)，室溫孵育2 h，ECL法顯影，并用凝膠化學成像分析儀記錄其灰度值。

3.7 ELISA法檢測Aβ42的生成 按照說明書收集各組細胞培養液1 mL，加入20 μL 廣譜蛋白酶抑制劑Protease Inhibitor Cocktail Set Ⅰ，至終濃度為1 mmol/L，分裝保存于-20 ℃。取出已包被的96孔板，加入標準品和待測樣品每孔各50 μL(每個樣品設置5個復孔)，立刻加入50 μL detection antibody同時設空白對照組，橡皮膏條封存，置室溫3 h。洗滌4遍后，甩掉板中液體后向每孔加入100 μL anti-rabbit IgG-HRP工作液, 橡皮膏條封存，置室溫30 min；再洗板4遍，甩掉板中液體，每孔加入100 μL stabilized chromogen, 液體變藍，橡皮膏條封存，置室溫避光30 min；然后每孔加入100 μL stop solution,終止顯色，此時藍色轉為黃色；最后用酶標儀在450 nm波長下讀取吸光度(A)值，然后根據標準曲線計算出Aβ42的濃度。

4 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 15.0統計學軟件對數據進行正態檢驗及方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 過表達NGB提高轉染pAPPswe的SH-SY5Y細胞的存活率

MTT檢測結果顯示，對照組(轉染pAPPswe的SH-SY5Y細胞)的存活率為0.687±0.098，空質粒轉染組的存活率為0.704±0.053，與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；而pNGB組細胞的存活率為0.883±0.074，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The effect of NGB over-expression on the survival of SH-SY5Y cells transfected with pAPPswe. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol or vector.

圖1 過表達NGB對轉染pAPPswe的SH-SY5Y細胞存活率的影響

2 過表達NGB提高轉染pAPPswe的SH-SY5Y細胞的線粒體膜電位

線粒體膜電位的降低通常被認為是細胞凋亡的早期現象。本實驗JC-1法檢測結果顯示，對照組細胞紅綠熒光的比值為(50.7±3.5)%，空質粒組紅綠熒光的比值為(52.4±4.2)%，2組比較無顯著差異；轉染pNGB后，過表達的NGB使細胞線粒體膜電位顯著提高，其紅綠熒光的比值為(76.5±5.9)%，與對照組和空質粒組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The effect of NGB over-expression on the mitochondrial membrane potential in pAPPswe-transfected SH-SY5Y cells. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol or vector.

圖2 過表達NGB對轉染pAPPswe的SH-SY5Y細胞內線粒體膜電位的影響

3 過表達NGB減少轉染pAPPswe的SH-SY5Y細胞的凋亡

流式細胞術結果顯示，對照組細胞早期凋亡率為(0.78±0.27)%，空質粒轉染組為(0.93±0.33)%，兩者比較差異沒有統計學意義(P>0.05)，而轉染pNGB組細胞早期凋亡率為(0.24±0.11)%，與上述2組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。而3組細胞的晚期凋亡率分別為(4.43±1.50)%、(4.04±0.59)%和(2.53±1.03)%，pNGB組與其它2組比較，差異也有統計學意義(P<0.01)，見圖3。

4 過表達NGB通過激活PI3K/Akt通路抑制轉染pAPPswe的SH-SY5Y細胞內caspase-3和caspase-9蛋白的表達

Western blotting檢測結果顯示，與對照組和空質粒轉染組比較，pNGB組細胞內的caspase-3和caspase-9蛋白水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；p-Akt的表達水平則明顯增高(P<0.01)；而Akt的表達沒有顯著變化(P>0.05)。在使用PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002處理后，細胞內的caspase-3和caspase-9蛋白水平明顯增高，而p-Akt蛋白表達水平卻降低，與pNGB轉染組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖4。

Figure 3.The effect of NGB over-expression on the apoptosis of pAPPswe-transfected SH-SY5Y cells detected by flow cytometric analysis.

圖3 過表達NGB對轉染pAPPswe的SH-SY5Y細胞凋亡的影響

Figure 4.Effects of NGB over-expression on the protein levels of caspase-3, caspase-9, Akt and p-Akt in pAPPswe-transfected SH-SY5Y cells.A: the protein levels of caspase-3, caspase-9, Akt and p-Akt determined by Western blotting; B: the quantitative analysis of relativeAvalues of caspase-3, caspase-9, Akt and p-Akt.Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol or pNGB+LY 294002.

圖4 過表達NGB對轉染pAPPswe的SH-SY5Y細胞內caspase-3、caspase-9、Akt和p-Akt蛋白水平的影響

5 過表達NGB明顯降低Aβ42生成

在正常的情況下或者腫瘤細胞內，我們極少可以檢測到Aβ42。而如圖5顯示，在SH-SY5Y細胞轉染pAPPswe后，我們可以檢測到Aβ42的生成量約為(34.1±3.5) ng/L，這表明AD的細胞模型成功建立，進而可以進行后續實驗。在轉染空質粒后，Aβ42的生成量約為(33.5±4.7) ng/L，與對照組比較，兩者沒有顯著差異(P>0.05)。成功轉染NGB后，過表達的NGB可明顯降低Aβ42的生成，生成約為(21.3±2.5) ng/L，與對照組和空質粒組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。

討 論

人神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y是一種具有低分化的腫瘤細胞。由于其增殖速度快，在形態上，生理和生化等功能上與人正常的神經細胞相似，因此已作為一種經典的體外實驗模型被廣泛用于神經系統疾病的發病機制[8]和藥物治療、預防機制[9]等的研究中。而在課題組前期的研究中[7]，我們利用pAPPswe轉染SH-SY5Y細胞產生了可檢測到的Aβ，為探討curcumin抑制Aβ治療AD的潛在機制研究提供了可靠的AD的細胞模型。因此，本實驗仍然利用pAPPswe轉染SH-SY5Y細胞建立AD的細胞模型。本研究中，pAPPswe轉染SH-SY5Y細胞后，淀粉樣蛋白前體(amyloid protein precursor, APP)的活性增強，促進了APP的裂解，不僅產生了可以被檢測到的Aβ42，而且也導致了細胞存活率的降低，線粒體膜電位也降低，細胞凋亡甚至導致細胞的死亡。這些都表明模型是建立成功的。在轉染NGB后，SH-SY5Y細胞過表達NGB能夠顯著提高細胞的存活率，恢復了線粒體膜電位的水平并且降低細胞的凋亡率，而且還降低了細胞上清中Aβ42的含量，這些都表明NGB對SH-SY5Y細胞具有神經保護作用。

Figure 5.Over-expression of NGB significantly decreased the generation of Aβ42.Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol or vector.

圖5 過表達NGB明顯降低Aβ42生成

眾所周知，凋亡的過程主要分為以下幾個階段：接受凋亡信號、凋亡調控分子間的相互作用、蛋白水解酶的活化、后進入連續反應過程。其中，caspases是特異性凋亡信號轉導分子，其激活被是凋亡發生機制中最關鍵的環節之一。Caspases家族成員眾多，其中caspase-8/9/10是凋亡的啟動子，而caspase-3/6/7為凋亡的執行者。研究已經證實，caspase與AD密切相關。Li等[10]研究發現，Aβ在引起星形膠質細胞和小腦顆粒細胞凋亡的過程中， caspases-2、3、6活性增加，三者各自的抑制劑對Aβ誘導的凋亡起到明顯的保護作用，表明多種caspases參與了Aβ誘導的凋亡。Francois等[11]的研究證明，APP存在3個caspase-3的剪切位點：(P4)DNVD197(P1)/S、(P4) DYAD219(P1)/G和(P4)VEVD720(P1)/A。APP被caspases剪切后的胞內羧肽片段C31參與Aβ誘導的凋亡。而Aβ誘導的凋亡又促進caspases的激活和APP的裂解。Raina等[12]也發現在AD大腦皮層和海馬神經元中caspase-3的活性與βAPP的斷裂，Aβ的升高及老年斑的形成是一致的。Caspases對βAPP的剪切破壞了細胞內APP的正常代謝過程，向著生成Aβ的方向進行，引起更多的Aβ生成和沉積，Aβ介導的毒性又促進caspases對APP的裂解，從而形成惡性循環。因此，我們推測過表達NGB降低Aβ42的生產以及降低Aβ誘導的細胞損傷的機制可能是通過抑制caspases的活性實現的。本實驗結果表明，過表達NGB能夠明顯降低與凋亡密切相關的caspase-3和caspase-9蛋白水平的表達，這進一步證實了線粒體凋亡途徑直接參與了Aβ誘導的凋亡過程，在AD的發生發展過程中發揮了重要作用，而NGB發揮其神經保護作用與抑制caspase-3和caspase-9的活性進而抑制凋亡的發生并且降低Aβ42的生成形成的良性循環有關。

研究發現caspase-9是PI3K/Akt信號通路下游的靶基因[13]，應用高濃度的PI3K抑制劑后會阻斷Akt的磷酸化，從而增強caspase-9蛋白的磷酸化，促進其下游分子引起的一系列串聯反應而加快凋亡進程，而抑制神經干細胞的存活[14]。新近的研究發現，NGB是PI3K/Akt信號通路的誘導劑[15]。因此我們認為，NGB有可能是通過激活PI3K/Akt信號通路，進而抑制下游靶基因caspases的活性而抑制神經元的凋亡，從而保護神經元。在本實驗中，我們發現過表達NGB能夠降低caspase-3和caspase-9的蛋白水平表達，并且增加Akt磷酸化水平，而這種作用可以被PI3K/Akt信號通路的特異性抑制劑LY294002所拮抗，這說明PI3K/Akt通路參與了NGB抑制caspase-3和caspase-9的活性，促進細胞的生長等過程。

綜上所述，過表達NGB不僅能夠減少Aβ的生成，而且還能夠削弱Aβ誘導的細胞損傷，而其機制可能是通過激活PI3K/Akt信號通路進而抑制與細胞凋亡密切相關的caspase-3、caspase-9等活性，這將為防治AD提供新的思路。

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Prevention and treatment of AD by over-expression of neuroglobin via activating PI3K/Akt signaling pathway

YANG Jun, DAI Song-yang, XIANG Yue, ZHANG Xiong

(InstituteofNeuroscience，ChongqingMedicalUniversity,ChongqingKeyLaboratoryofNeurobiology,Chongqing400016,China.E-mail:zhangxiong_0@aliyun.com)

AIM: To study the neuroprotective roles of neuroglobin (NGB) over-expression in the SH-SY5Y cells transfected with pAPPswe.METHODS: The plasmid pEGFP-NGB was successfully constructed and transfected into the SH-SY5Y cells, which were pretreated with pAPPswe. MTT assay was applied to detect the effect of NGB over-expression on the cell survival rates. JC-1 staining was used to detect the level of mitochondrial transmembrane potential. The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The effects of NGB over-expression on the protein level of p-Akt, Akt and caspase-3/9 were determined by Western blotting. The generation of Aβ42in the cells was measured by ELISA.RESULTS: The cell survival rate was remarkably increased after transfection with NGB compared with control group and empty plasmid group (P<0.05). The over-expression of NGB significantly inhibited the decrease in mitochondrial membrane potential induced by pAPPswe. The over-expression of NGB inhibited the apoptosis of the cells. Furthermore, over-expression of NGB not only inhibited the expression of caspase-3 and caspase-9, but also induced the production of p-Akt, which was prevented by LY294002, an inhibitor of PI3K/Akt. The generation of Aβ42was inhibited in the cells with the over-expression of NGB. CONCLUSION: Over-expression of NGB significantly inhibits the SH-SY5Y cell injuries induced by pAPPswe and inhibits the expression of caspase-3/9, which is tightly related with cell apoptosis. Furthermore, the neuroprotective roles of NGB may be via activating PI3K/Akt signaling pathway.

Neuroglobin; SH-SY5Y cells; Apoptosis; Caspase-3/9； PI3K/Akt signaling pathway

1000- 4718(2014)12- 2166- 06

2014- 07- 18

2014- 09- 16

國家青年科學基金資助項目 (No. 81100948)

R363； R749.1+6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.009

△通訊作者 Tel: 023-68485898； E-mail: zhangxiong_0@aliyun.com