中介素抑制高肺血流性肺動脈高壓大鼠肺組織膠原生成*

龐璐璐， 齊建光， 高 揚， 金紅芳， 杜軍保

(北京大學第一醫院兒科，北京 100034)

中介素抑制高肺血流性肺動脈高壓大鼠肺組織膠原生成*

龐璐璐， 齊建光△， 高 揚， 金紅芳， 杜軍保

(北京大學第一醫院兒科，北京 100034)

目的： 研究中介素(IMD)對高肺血流性肺動脈高壓大鼠肺組織膠原生成和沉積的調節作用及其機制。方法: 健康雄性SD大鼠20只，隨機分為對照組(n=7)、分流組(n=7)和分流+IMD組(n=6)。對后2組大鼠行腹主動脈-下腔靜脈分流術。8周后，對分流+IMD組大鼠，皮下埋微量滲透泵持續給予IMD 1.5 μg·kg-1·h-1。繼續飼養2周后，比較各組大鼠肺動脈平均壓(mPAP)、肺中、小動脈相對中膜厚度(RMT)，肺組織羥脯氨酸、Ⅰ和Ⅲ 型膠原、骨形成蛋白-2(BMP-2)含量和I、III型前膠原mRNA表達水平。結果: 與對照組相比，分流組大鼠mPAP明顯上升，肺中、小動脈RMT明顯增加，肺組織羥脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型膠原含量明顯增多，Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達上調，BMP-2含量明顯增多。IMD則使分流大鼠肺動脈壓力明顯回降，肺血管結構改變緩解，膠原沉積減少，BMP-2含量降低，Ⅰ、Ⅲ 型前膠原mRNA表達下調。結論: IMD可通過抑制高肺血流大鼠肺組織膠原生成和沉積，緩解高肺血流性肺動脈高壓和肺血管結構重構形成，該作用可能與BMP-2途徑有關。

肺動脈高壓; 高肺血流; 膠原; 中介素

中介素(intermedin, IMD)是近年來發現的一種心血管保護性多肽，參與了多種心血管疾病的發生發展過程。既往研究顯示，IMD可呈劑量依賴性地舒張肺血管，降低肺動脈壓力[1]。我們新近的研究表明，外源性應用IMD可緩解高肺血流大鼠肺動脈高壓和肺血管結構重構的形成[2]。膠原構成細胞外基質的框架，以膠原沉積為主要特征的肺血管基質重塑是高肺血流性肺血管結構重構的重要組成部分[3]。IMD是否可通過干預肺組織膠原合成和沉積從而調節高肺血流性血管結構重構和肺動脈高壓的形成，目前尚不清楚。本研究通過觀察長期應用IMD對高肺血流大鼠肺組織膠原合成和沉積的影響及機制，探討IMD對高肺血流性肺動脈高壓和肺血管結構重構的作用機制。

材 料 和 方 法

1 動物

清潔級雄性SD大鼠20只，體重160g±10 g，購自軍事醫學科學院(SCXK-2007-004)。

2 主要儀器和試劑

微量滲透泵2002型購自ALZE；中介素購自Phoenix；引物和探針由上海生工生物工程有限公司合成；大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原酶聯免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒購自武漢伊艾博科技有限公司；羥脯氨酸試劑盒和大鼠骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2) ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

3 主要方法

3.1 動物模型的制備及給藥 將20只SD大鼠隨機分為3組：對照(control)組(n=7)，分流(shunt)組(n=7)和分流+IMD(shunt+IMD)組(n=6)。分流組和分流+IMD 組大鼠行腹主動脈-下腔靜脈分流術[4]。大鼠腹腔注射10%水合氯醛3～4 mL/kg麻醉后，取仰臥位固定于手術臺上。腹部正中切口，沿腹主動脈左側壁分開后腹膜，顯露腹主動脈及下腔靜脈，用哈巴狗鉗于左腎動脈起始部下方將腹主動脈夾閉。以腹主動脈的左腎動脈起始部至其末端段的下2/3處之左側壁為穿刺點，用12號一次性針頭以45°角穿透腹主動脈壁進入相鄰的下腔靜脈內，撤出針頭，再用9-0號線縫合腹主動脈壁的穿刺口。之后移開哈巴狗鉗，若觀察到下腔靜脈顏色由暗變紅，血流有波動，證實分流手術成功。用4號絲線分別連續縫合腹膜、肌層和皮膚。對照組僅開腹暴露腹主動脈及下腔靜脈，不做分流術。大鼠飼養8周后，對分流+IMD組大鼠，于背部皮下做一長約1 cm切口，埋置微量滲透泵，持續皮下給藥2周，劑量為1.5 μg·kg-1·h-1。各組大鼠飼養條件相同。

3.2 肺動脈壓力的測定 于實驗10周后(第70天)以右心導管法測定肺動脈壓力[5]。大鼠腹腔注射10%水合氯醛3～4 mL/kg麻醉。分離大鼠右側頸外靜脈，將聚乙烯導管一端插入右側頸外靜脈，經上腔靜脈、右心房、右心室進入肺動脈，另一端經壓力傳感器與多導生理記錄儀(成都泰盟科技有限公司)相連，描記肺動脈壓力曲線，記錄肺動脈平均壓(mean pulmonary artery pressure, mPAP)。

3.3 肺中、小動脈相對中膜厚度的觀測 大鼠開胸取相同部位肺葉固定于4%多聚甲醛中，乙醇脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，切片。以醛復紅染色彈力纖維。光鏡下觀察切片的肺肌型動脈(在光鏡下具有完整的內外兩層彈力層)。應用CMIAS 圖像處理與分析系統(Leica)計算肺中、小肌型動脈的相對中膜厚度(relative medial thickness, RMT)，每只大鼠測量6～10個肺中型(外徑50～150 μm)和小型(15～50 μm)肌型動脈的RMT，然后求其均值作為該大鼠的RMT值[6]。

3.4 肺組織羥脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的測定 稱取肺組織，加入10倍體積的緩沖液，勻漿后采用南京建成羥脯氨酸含量的測定試劑盒測定肺組織羥脯氨酸含量，操作嚴格按說明書進行。

ELISA法測定肺組織Ⅰ、Ⅲ型膠原含量，操作嚴格按說明書進行。

3.5 肺組織Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達水平的測定 Trizol法提取大鼠肺組織總RNA，逆轉錄為cDNA。用real-time PCR法檢測大鼠肺組織Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達水平。PCR反應體系為25 μL(cDNA 1 μL, 2.5 mmol/L dNTP 1 μL，5 pmol/L TaqMan探針1 μl，ROX 0.5 μL，7.5 pmol/L上、下游引物混合物1 μL，10× PCR 緩沖液2.5 μL以及DNA聚合酶0.25 μL)。用β-actin為內參照校正Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達水平。引物和探針序列見表1。

3.6 肺組織BMP-2含量的測定 ELISA法測定肺組織BMP-2含量，操作嚴格按說明書進行。

4 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 16.0統計軟件分析，均數間比較采用單因素方差分析，2組之間的比較采用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

表1 引物和探針序列

FAM: 5-carboxyfluorescein; TAMRA: 5-carboxytetramethylrhodamine.

結 果

1 IMD降低肺動脈平均壓

分流組大鼠mPAP顯著升高(P<0.01)，IMD則使分流大鼠mPAP明顯降低(P<0.01)，見表2。

2 IMD降低肺中、小動脈相對中膜厚度

與對照組相比，分流組大鼠肺中、小肌型動脈RMT明顯升高(P<0.01)，IMD則使分流大鼠肺中、小肌型動脈RMT明顯降低(P<0.05),見表2。

表2 大鼠血流動力學及形態學指標

mPAP: mean pulmonary artery pressure; PA: pulmonary artery；**P<0.01vscontrol group;△P<0.05,△△P<0.01vsshunt group.

3 IMD減輕肺組織膠原沉積

與對照組相比，分流組大鼠肺組織勻漿羥脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型膠原含量明顯升高(P<0.01)。IMD則使分流大鼠肺組織勻漿羥脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型膠原含量明顯降低(P<0.01)，見表3。

4 IMD減少肺組織前膠原合成

與對照組相比，分流組大鼠肺組織Ⅰ、Ⅲ型前膠原 mRNA水平明顯升高(P<0.05)。IMD則使分流大鼠肺組織Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA水平明顯降低(P<0.05)，見圖1。

5 IMD降低肺組織BMP-2含量

與對照組相比，分流組大鼠肺組織BMP-2明顯升高(P<0.01)。IMD則使分流大鼠肺組織BMP-2含量明顯降低(P<0.05)，見表3。

表3 肺組織羥脯氨酸、Ⅰ、Ⅲ 型膠原及BMP-2含量

BMP-2: bone morphogenetic protein-2.**P<0.01vscontrol group;△P<0.05,△△P<0.01vsshunt group.

Figure 1.The expression of procollagen Ⅰ (A) and Ⅲ(B) mRNA in the lung of rats. Mean±SD.n=6～7.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;△P<0.05,△△P<0.01vsshunt group.

圖1 肺組織I、III型前膠原mRNA的表達

討 論

肺血管結構重構是高肺血流性肺動脈高壓發生的重要病理生理基礎[7]，其主要特征是肺血管內皮細胞和平滑肌細胞異常增殖，細胞外基質重塑，血栓和纖維化形成。肺血管結構重構和肺動脈高壓的程度是影響先天性心臟病治療時機和預后的重要因素[8]。目前關于高肺血流性肺血管結構重構的形成機制尚不完全清楚，眾多血管活性物質可能參與了其發生發展[9]。

IMD是Roh等[10]2004年在硬骨魚體內發現一種血管活性肽，為降鈣素基因相關肽超家族的一員，可非選擇性地與三型降鈣素受體樣受體/受體活性調節蛋白受體復合物結合，從而發揮其舒張血管，減輕缺血再灌注損傷的作用。研究顯示，IMD可呈劑量依賴性地舒張肺血管，降低肺動脈壓力[1]。在慢性低氧所致的肺動脈高壓大鼠模型中，肺組織IMD及其受體表達增多[11]，新近研究表明IMD可抑制低氧所致的大鼠肺血管平滑肌細胞增殖和肺血管重構的發生[12]。以上研究結果提示，IMD參與了低氧性肺動脈高壓的病理生理過程。我們課題組新近應用皮下埋置微量滲透泵的方法，對腹主動脈-下腔靜脈分流大鼠外源性應用IMD，發現IMD亦可緩解大鼠高肺血流性肺血管結構重構的發生[2]。但IMD緩解大鼠高肺血流性肺血管結構重構的機制尚不清楚。

膠原是肺血管細胞外基質的重要組成部分。肺血管壁的膠原成分主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原，其中Ⅰ型膠原與抗張力有關，Ⅲ型膠原與血管壁的彈性有關。膠原代謝異常使Ⅰ、Ⅲ型膠原絕對和相對含量改變，可導致肺動脈管壁增厚，管腔變小，血管順應性下降，最終導致肺血管結構重構和肺動脈高壓的形成[3]。有研究發現，在膽固醇誘導的心肌纖維化的大鼠模型中，外源性應用IMD可減少心肌成纖維細胞膠原合成，抑制心肌纖維化的形成[13]，提示IMD具有調節膠原合成的作用。但IMD對高肺血流大鼠肺組織膠原合成和沉積的作用，以及IMD對于肺組織膠原合成和沉積的作用是否參與了其對高肺血流性肺動脈高壓和肺血管結構重構形成的調節機制尚不清楚。在本研究中，我們發現分流大鼠肺組織羥脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型膠原含量升高，IMD則使分流大鼠肺組織膠原沉積減輕。提示IMD可通過抑制肺組織膠原沉積，緩解肺血管基質重塑，從而減輕高肺血流性肺血管結構重構和肺動脈高壓。

IMD緩解肺組織膠原沉積的機制尚不清楚。膠原合成和降解失衡導致膠原絕對和相對含量的改變是肺組織膠原沉積增多的重要原因。IMD是否可通過抑制膠原合成緩解高肺血流大鼠肺組織膠原沉積目前尚不清楚。我們的研究結果發現，IMD在緩解高肺血流大鼠肺組織膠原沉積的同時，可降低Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達。提示IMD可能通過抑制肺組織膠原合成，從而抑制膠原沉積，緩解高肺血流性肺血管結構重構和肺動脈高壓的形成。

BMP-2是轉化生長因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)超家族的一員，可通過Smads信號通路發揮調節細胞增殖、凋亡和細胞外基質合成的作用。多項研究表明，BMP-2通路的改變參與了肺動脈高壓和肺血管結構重構的發生。既往研究表明，外源性應用BMP-2可抑制肺動脈平滑肌細胞增殖和內皮素-1(endothelin-1, ET-1)誘導的肺成纖維細胞α-平滑肌肌動蛋白表達及成纖維細胞遷移[14-15]。BMP-2基因雜合缺失的小鼠肺血管阻力增高，且在炎癥、低氧和血清素刺激下更易發生肺動脈高壓[16]。本實驗研究結果發現，IMD在緩解高肺血流大鼠肺組織膠原生成和沉積以及肺血管結構重構的同時，可使高肺血流大鼠肺組織BMP-2蛋白含量明顯下降，提示IMD 抑制高肺血流大鼠肺組織膠原生成與肺血管結構重構的作用可能與BMP-2通路有關。由于機體是多種體液因素參與的復雜的整體，IMD對于BMP-2通路的具體影響和調節途徑尚需進一步研究。

總之，我們的研究結果顯示，IMD通過抑制肺組織膠原合成和堆積，從而緩解高肺血流性肺動脈高壓和肺血管結構重構的形成，此作用可能與BMP-2通路有關。這為高肺血流性肺動脈高壓的臨床治療提供了新的思路。

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Intermedin inhibits pulmonary collagen synthesis in rats with pulmonary hypertension induced by high pulmonary blood flow

PANG Lu-lu, QI Jian-guang, GAO Yang, JIN Hong-fang, DU Jun-bao

(DepartmentofPediatrics,FirstHospitalofPekingUniversity,Beijing100034,China.E-mail:qijianguang@sohu.com)

AIM: To explore the regulatory effect of intermedin (IMD) on pulmonary collagen synthesis and accumulation in rats with pulmonary hypertension induced by high pulmonary blood flow.METHODS: Healthy male SD rats (n=20) were randomly divided into control group (n=7), shunt group (n=7) and shunt with IMD group (n=6). The shunting of abdominal aorta and inferior vena cava was produced in rats of shunt group and shunt with IMD group. After 8 weeks, IMD was administered into the rats of shunt with IMD group subcutaneously by mini-osmotic pump for 2 weeks. Mean pulmonary artery pressure (mPAP), relative medial thickness (RMT) of pulmonary arteries, contents of hydroxyproline, collagen type I and III, bone morphogenetic protein-2 (BMP-2), and the mRNA expression of procollagen I and III in lung tissues were measured and compared. RESULTS: Compared with control group, mPAP and RMT of medium and small pulmonary arteries in the rats of shunt group were significantly increased. Meanwhile, the lung hydroxyproline, collagens I and III and BMP-2 contents, and the mRNA expression of lung procollagen I and III were all significantly increased compared with control group. However, IMD significantly decreased mPAP, alleviated the changes of pulmonary vascular micro-structure, decreased the collagen accumulation and pulmonary tissue homogenate BMP-2 contents, and inhibited the mRNA expression of procollagen I and III in the lung tissue of shunting rats.CONCLUSION: IMD plays a protective role in the development of pulmonary hypertension and pulmonary vascular structural remodeling induced by high blood flow by inhibiting pulmonary collagen synthesis and accumulation, possibly in association with the BMP-2 pathway.

Pulmonary hypertension; High pulmonary blood flow; Collagen; Intermedin

1000- 4718(2014)12- 2185- 05

2014- 07- 02

2014- 08- 22

國家自然科學基金資助項目(No.30973226)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.012

△通訊作者 Tel: 010-83573238; E-mail: qijianguang@sohu.com