MicroRNA-132轉染對脂多糖誘導的肺泡巨噬細胞炎癥反應的作用*

藍琳友， 洪溪屏， 蔡元暉

(溫州醫科大學附屬第五醫院急診科，浙江 麗水 323000)

MicroRNA-132轉染對脂多糖誘導的肺泡巨噬細胞炎癥反應的作用*

藍琳友△， 洪溪屏， 蔡元暉

(溫州醫科大學附屬第五醫院急診科，浙江 麗水 323000)

目的： 探討轉染微小RNA-132(miR-132)對肺泡巨噬細胞炎癥反應的作用。方法: 將體外去致熱源培養的大鼠肺泡巨噬細胞株NR8383分為空白對照組、陰性對照組和轉染組，分別采用miR-132增敏劑、錯義鏈和PBS作用。轉染24 h后，CCK-8法檢測細胞増殖；實時熒光定量PCR檢測細胞中miR-132的表達；用脂多糖(LPS)作用細胞后，凝膠電泳遷移率實驗(EMSA)檢測細胞中NF-κB活性；Western blotting法檢測細胞中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素6(IL-6)的表達。結果: 與空白對照組和陰性對照組相比較，轉染組細胞中miR-132的表達明顯升高；轉染組細胞増殖被明顯抑制，與空白對照組相比較，差異有統計學意義(P<0.05)；LPS作用后，轉染組NF-κB、TNF-α和IL-6表達量顯著下降，與空白對照組和陰性對照組相比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論: 轉染miR-132可抑制NR8383細胞増殖，并抑制LPS誘導的NR8383細胞的炎癥反應。

MicroRNA-132； 肺泡巨噬細胞； 炎癥反應

近年來研究表明，微小RNA(microRNAs, miRNAs)作為內源性非編碼小分子RNA，在組織炎癥反應、細胞增殖與凋亡、組織分化和腫瘤形成等多種生理過程起重要調節作用[1]。其中miR-132是當前研究熱點之一，miR-132不僅在病毒感染及免疫反應過程中發揮重要作用[2-3]，另外在LPS誘導肺泡巨噬細胞產生炎癥反應中，miR-132的表達與炎癥因子表達呈負相關[4]，表明miR-132可能作為抑制肺泡巨噬細胞炎癥反應的新作用靶點。為進一步明確miR-132調控肺泡巨噬細胞炎癥反應中的作用機制，本研究觀察轉染miR-132對肺泡巨噬細胞NR8383生長和炎癥因子表達的影響。

材 料 和 方 法

1 實驗材料及主要試劑

胎牛血清、Ham’s F-12K培養基和0.25% EDTA胰蛋白酶購自Gibco；細胞漿蛋白抽提試劑盒、CCK-8試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)購自R&D；EMSA試劑盒購自Pierce；TNF-α、IL-6和β-actin抗體購自Epitomics；Lipofectamine 2000購自Invitrogen；CyTM3標記miRNA-132 mimic和miRNA-132錯義鏈購自銳博生物科技有限公司；Trizol和PCR引物購自Invitrogen；Prime Script逆轉錄試劑盒購自ABI。

2 細胞培養、實驗模型制備及分組

大鼠肺泡巨噬細胞株NR8383購自中科院上海細胞庫，培養在含15%胎牛血清、質量濃度1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺和1.5 g/L碳酸氫鈉的Ham’s F-12K培養液中，置于37 ℃、5%的CO2的培養箱內培養，2～3 d換液1次，細胞單層貼壁生長至70%～80%融合時胰蛋白酶消化傳代。

將處于對數生長期的NR8383細胞按4×106/well接種到6孔板，每孔2 mL，細胞貼壁后分3組：(1)空白對照組：在培養基中加入濃度為50 nmol/L的Lipofectamine 2000和PBS；(2)陰性對照組：每孔加入50 nmol/L的CyTM3標記miRNA-132錯義鏈；(3)轉染組：在培養基中加入濃度為50 nmol/L 的CyTM3標記miRNA-132 mimic。培養24 h后收集細胞，在熒光顯微鏡下觀察轉染效率，real-time PCR檢測細胞中miRNA-132的表達，繼續放置培養箱中培養24 h后再加入濃度為1 mg/L的LPS。細胞放入培養箱6 h后離心收集細胞，置于-80 ℃冰箱。

3 主要方法

3.1 Real-time PCR檢測NR8383細胞中miR-132的表達 用Trizol試劑提取總RNA，按說明書操作?？俁NA經紫外分光光度計測定260 nm與280 nm處吸光度比值(A260/A280)為1.9～2.1，瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA純度。采用PrimeScript逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，采用SYBR實時熒光定量試劑盒進行實時定量PCR檢測，反應在25 μL體系中進行，反應條件：94 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 7 min。以U6 snRNA作為內參照，miR-132的相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算。

3.2 CCK-8法檢測細胞增殖 收集轉染后的各組NR8383細胞，制成單細胞懸液，以每孔4×103個細胞接種到96孔板，每孔200 μL，細胞貼壁后放置培養箱分別培養12 h、24 h、36 h和48 h，每組設5個復孔，同時設置空白調零組(不加細胞，加入等量的PBS)。培養結束前1 h，各孔加入CCK-8溶液0.01 mL后繼續培養1 h，酶標儀測A450值，實驗重復3次。細胞存活率(%)=(實驗組A450值-空白調零組A450值)/(對照組A450值-空白調零組A450值)×100%。

3.3 Western blotting檢測NR8383細胞中TNF-α和IL-6的表達 裂解細胞并分離細胞蛋白質，用Bradford法測量蛋白濃度后取等量蛋白質樣品(20 μg)，常規8% SDS-PAGE分離蛋白，半干轉膜儀轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入特異性Ⅰ抗(1∶1 000)于4 ℃下孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG為Ⅱ抗(1∶2 500)室溫孵育1 h，ECL顯色，條帶曝光強度用Quantity One 4.6.2(Bio-Rad)軟件分析，以β-actin為內參照，通過與內參照的灰度比得出目的條帶的相對表達水平。

3.4 EMSA實驗 裂解細胞后提取核蛋白。EMSA實驗方法參照文獻[5]進行，探針序列為: 5′-TACTAGCTAGTTCGTGTCAG-3′，將6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠在電壓為120 V條件下恒壓電泳60 min，取10 μg核蛋白加入超純水中室溫反應30 min后再加入生物素標記探針，在室溫下反應30 min后電泳100 min再印跡轉移，用帶正電荷尼龍膜380 mA恒流電轉40 min，轉移完后將尼龍膜至于紫外燈下交聯15 min，將膜再用30 mL封閉液在室溫下反應20 min，最后將膜放入平衡液中反應15 min，化學發光顯色，條帶曝光強度用Quantity One 4.6.2(Bio-Rad)軟件分析，計算灰度值。

4 統計學處理

采用SPSS 11.5軟件包進行統計學處理，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，正態分布變量多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 熒光顯微鏡下觀察細胞轉染

NR8383細胞經轉染CyTM3標記miR-132后，綠色熒光激發轉染成功的細胞中的CyTM3發射出紅光，在倒置熒光顯微鏡下觀察，在NR8383細胞內可見大量顆粒狀熒光，表明轉染細胞成功，見圖1。

Figure 1.Morphology of the rat alveolar macrophages NR8383 were observed under the fluorescence microscopy after transfected with miR-132 mimic (×100).

圖1 熒光顯微鏡下觀察CyTM3標記miR-132轉染NR8383細胞的結果

2 各組NR8383細胞中miR-132的表達

Real-time PCR結果表明，在空白對照組、陰性對照組和轉染組中miR-132的相對表達量分別為5.84±2.03、6.92±1.83和23.34±5.17。與空白對照組和陰性對照組相比較，轉染組中miR-132的表達顯著上調，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The relative expression of miR-132 in NR8383 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control group；#P<0.05vsnegative control group.

圖2 miR-132在各組NR8383細胞中的表達

3 CCK-8法檢測各組NR8383細胞增殖

CCK-8實驗的結果表明，在各個時點轉染組的細胞增殖速度均明顯低于空白對照組或陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

4 轉染miR-132對NR8383細胞中NF-κB活性的影響

各組NR8383細胞中均有不同程度的NF-κB活性表達，LPS作用后可顯著上調NR8383細胞中NF-κB的活性；與空白對照組或陰性對照組相比較，NF-κB活性在轉染組中明顯下降，差異有統計學意義(P< 0.05)，見圖4。

Figure 3.CCK-8 assay was used to determine the proliferation of NR8383 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblack control group；#P<0.05vsnegative control group.

圖3 CCK-8法檢測轉染miR-132對NR8383細胞增殖的影響

Figure 4.The NF-κB DNA-binding activity in NR8383 cells was measured by EMSA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS.

圖4 EMSA檢測各組細胞中NF-κB活性

5 Western blotting檢測TNF-α和IL-6在NR8383細胞中的表達

Western blotting檢測結果表明，與空白對照組相比較，LPS作用后NR8383細胞中TNF-α和IL-6的水平明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；而TNF-α和IL-6在轉染組的水平較空白對照組或陰性對照組顯著下降，有顯著差異(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.Western blotting analysis of TNF-α and IL-6 in NR8383 cells. β-actin protein served as loading control.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS.

圖5 Western blotting檢測TNF-α和IL-6在NR8383細胞中的表達

討 論

肺泡巨噬細胞在肺損傷時被激活，肺泡巨噬細胞不但可吞噬侵入肺臟的炎癥粒子，參與肺臟的防御和免疫，而且還能分泌大量的生物活性物質參與中性粒細胞在肺內的遷徙過程，因此在急性肺損傷過程中發揮了關鍵作用[6]。LPS是革蘭氏陰性桿菌細胞壁的主要致病成分，也是膿毒癥主要致病因素，在膿毒血癥過程中，LPS可活化肺泡巨噬細胞Toll樣受體/核轉錄因子(NF-κB)炎癥通路，導致大量炎癥因子如TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1釋放，最終引起急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的發生[7-8]。TNF-α作為炎癥反應過程中出現最早和最重要的炎癥介質，能激活中性粒細胞和淋巴細胞，使血管內皮細胞通透性增加，調節其它組織代謝活性并促使其它細胞因子的合成和釋放，而IL-6能誘導B細胞分化和產生抗體，并誘導T細胞活化增殖、分化，參與機體的免疫應答，是炎癥反應的促發劑[9]。在本研究采用LPS刺激肺泡巨噬細胞株NR8383來建立炎癥反應模型，并檢測NF-κB、TNF-α和IL-6在巨噬細胞中的表達來判斷模型是否建立成功和炎癥反應程度。本研究結果表明，LPS作用NR8383細胞后，活化NF-κB表達增加，同時TNF-α和IL-6蛋白表達顯著上調，從而成功建立起炎癥反應模型，與文獻報道相符合[4]。

miRNAs是一類非編碼小分子RNA，miRNAs可通過特異性識別靶基因mRNA的3′端非編碼區位點而抑制蛋白翻譯或誘導mRNA的降解，從而在轉錄后水平調控基因表達[1-3]。近年來研究表明miRNAs在機體炎癥反應過程中發揮了一定作用。有研究表明，轉染miR-146a后可下調巨噬細胞中多種炎癥因子的表達[10]；而miR-132作為當前微小RNA研究的熱點之一，劉芬等[4]觀察到肺泡巨噬細胞miR-132表達上調后可下調肺泡巨噬細胞中TNF-α的表達，同時miR-132的表達在炎癥性腸病中的表達明顯高出正常腸組織中的表達[3]，從而表明miR-132與肺泡巨噬細胞介導的炎癥反應關系密切，但尚未有轉染miR-132對肺泡巨噬細胞介導的炎癥反應的作用報道。在本研究中，NR8383細胞經轉染CyTM3標記miRNA-132后，在倒置熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光激發轉染成功的細胞中的CyTM3發射出紅光，同時轉染組NR8383細胞中miRNA-132表達明顯上調，表明轉染細胞miRNA-132成功；在分析轉染miRNA-132后對NR8383細胞增殖影響的實驗中，CCK-8結果表明，轉染miRNA-132后對NR8383細胞增殖有明顯抑制作用；另外本研究通過轉染miR-132到巨噬細胞后觀察到miR-132的表達明顯增加，同時上調miR-132可顯著下調NF-κB、TNF-α和IL-6在巨噬細胞中的表達，從而首次表明miR-132可通過Toll樣受體/ NF-κB炎癥通路抑制巨噬細胞的炎癥反應。

綜上所述，本研究成功建立起LPS誘導產生的肺泡巨噬細胞炎癥反應模型，轉染miR-132至巨噬細胞后可抑制細胞增殖，同時抑制炎癥因子NF-κB、TNF-α和IL-6的表達，表明miR-132可通過Toll樣受體/ NF-κB炎癥通路抑制LPS誘導巨噬細胞產生的炎癥反應。

[1] 廖紫薇, 鄧紅霞, 張國平，等. 致癌性微小RNA-106a對正常胃黏膜上皮細胞和胃癌細胞生長的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(10):1885-1889.

[2] Hanieh H, Alzahrani A. MicroRNA-132 suppresses autoimmune encephalomyelitis by inducing cholinergic anti-inflammation: a new Ahr-based exploration[J]. Eur J Immunol, 2013, 43(10):2771-2782.

[3] Maharshak N, Shenhar-Tsarfaty S, Aroyo N, et al. MicroRNA-132 modulates cholinergic signaling and inflammation in human inflammatory bowel disease[J]. Inflamm Bowel Dis, 2013, 19(7):1346-1353.

[4] 劉 芬, 江 榕, 李 勇， 等.微小RNA-132在脂多糖誘導大鼠肺泡巨噬細胞炎癥反應中的表達變化[J]. 中華危重病急救醫學, 2014, 26(2):80-83.

[5] Wang YX,Yan A, Ma ZH, et al. Nuclear factor-κB and apoptosis in patients with intracerebral hemorrhage[J]. J Clin Neurosci, 2011, 18(10):1392-1395.

[6] 杜 濤, 黃 海, 陳欣脂，等. 多糖通過PI3K/Akt/mTOR通路調控巨噬細胞自噬[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(4):675-680.

[7] Zeng Z, Gong H,Li Y, et al. Upregulation of miR-132 contributes to the suppression of inflammatory responses in LPS-induced acute lung injury[J]. Exp Lung Res, 2013, 39(7):275-282.

[8] 許欣婷, 董明清, 胡 美，等. 骨髓來源間充質干細胞培養上清液減輕脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(2):286-290.

[9] Ramakrishna K,Pugazhendhi S, Kabeerdoss J, et al. Association between heat shock protein 70 gene polymorphisms and clinical outcomes in intensive care unit patients with sepsis[J]. Indian J Crit Care Med, 2014, 18(4):205-211.

[10]劉 芬, 曾振國, 聶 成，等.轉染微小RNA-146a對肺泡巨噬細胞腫瘤壞死因子-α表達的影響[J]. 中華危重病急救醫學, 2013, 25(6):335-338.

藍斑核的線粒體氧化應激受活性一氧化氮合成酶的調控

去甲腎上腺素能(noradrenergic, NA)藍斑核(locus coeruleus, LC)神經元支配大腦的大多數部位，保持大腦的醒覺狀態，并在興奮和緊張時期調節神經元的活動和可塑性。LC的缺失是老齡化相關的神經退行性疾病如帕金森病(Parkinson’s disease, PD)和阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease, AD)的主要特征。為了探討引起這類疾病的可能的生理因素，作者采用電生理學的方法和光鏡研究小鼠大腦切片，觀察小鼠LC神經元的異常變化。作者發現由于L型Ca2+通道的開放，LC神經元的自主活動伴隨著Ca2+濃度的擺動而變化。這種Ca2+濃度的擺動可以增強線粒體的氧化應激，但一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)受到抑制時，Ca2+濃度的振幅相應衰減，氧化應激也相應減弱。覺醒和二氧化碳都可以增加LC神經元的放電率，但它區別于線粒體氧化應激的影響，可見活動和應激之間的關系具有延展性。在PD的動物模型中，同樣可以觀察到氧化應激有增加的趨勢。因此，根據研究結果，作者指出活性依賴的Ca2+通道和所產生的線粒體氧化應激是加重LC神經元損傷的重要因素，并受NOS的調控。

Nat Neurosci, 2014, 17(6):832-840(劉紫萍)

Effect of microRNA-132 transfection on lipopolysaccharide-induced inflammation in rat alveolar macrophages

LAN Lin-you, HONG Xi-ping, CAI Yuan-hui

(EmergencyDepartment,TheFifthAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Lishui323000,China.E-mail:lanlinyou2013@163.com)

AIM: To investigate the effect of microRNA-132 (miR-132) transfection on the lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation in rat alveolar macrophages. METHODS: The rat alveolar macrophage NR8383 cultured without pyrogeninvitrowere divided into blank control group, negative control group and transfected group. The cells in the 3 groups were transfected with phosphate buffer solution (PBS), Lipofectamine 2000 and synthesized miR-132 mimic respectively. The cell proliferation was detected by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. Real-time PCR was used to detect the expression of miR-132 in the cells. After NR8383 cells were stimulated with LPS for 6 h, the NF-κB DNA-binding activity was measured by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). The expression of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) in NR8383 cells was assayed by Western blotting.RESULTS: After transfection, the expression of miR-132 was significantly higher than that in blank control group and negative control group. The growth of NR8383 cells in transfected group was significantly inhibited compared with blank control group and negative control group (P<0.05). After the cells were stimulated with LPS, the productions of NF-κB, TNF-α and IL-6 in transfected NR8383 cells were decreased compared with blank control group and negative control group (P<0.05).CONCLUSION: Transfection of alveolar macrophages with miR-132 significantly suppresses the cell growth, and inhibits inflammatory responses induced by LPS.

MicroRNA-132； Alveolar macrophages； Inflammatory response

1000- 4718(2014)12- 2190- 05

2014- 06- 16

2014- 09- 16

浙江省衛生廳資助項目(No. 2012A122)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.013

△通訊作者 Tel： 0578-2129120； E-mail： lanlinyou2013@163.com