ROS/PKC/p38 MAPK途徑在山茱萸多糖抑制心肌細胞缺氧/復氧損傷的作用*

來麗娜， 宋麗華， 張曉京， 張曉一， 雷靜文， 劉 芳， 郭春花， 宋曉亮

(長治醫學院藥學系，山西 長治 046000)

ROS/PKC/p38 MAPK途徑在山茱萸多糖抑制心肌細胞缺氧/復氧損傷的作用*

來麗娜， 宋麗華， 張曉京， 張曉一， 雷靜文， 劉 芳， 郭春花， 宋曉亮△

(長治醫學院藥學系，山西 長治 046000)

目的： 觀察山茱萸多糖(polysaccharide fromFructuscorni，PFC)對缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷心肌細胞的保護作用，并探討其對ROS/PKC/p38 MAPK途徑的影響。方法: 分離原代乳鼠心肌細胞，建立H/R模型，細胞分為7組：正常對照組(N組)、缺氧/復氧組(H/R組)、缺氧/復氧+PFC(終濃度20 mg/L、100 mg/L和200 mg/L)預處理組、缺氧/復氧+PFC(100 mg/L)預處理+蛋白激酶C特異性阻斷劑chelerythrine(1 μmol/L)組及缺氧/復氧+PFC(100 mg/L)預處理+p38 MAPK特異性阻斷劑SB203580(10 μmol/L)組。倒置顯微鏡下觀察細胞形態和自發搏動頻率，Hoechst 33258染色觀察細胞凋亡率，酶標儀測定ROS含量、SOD活性及LDH漏出量，免疫印跡法檢測PKC、p-p38 MAPK和HSP70的蛋白水平。結果: H/R組細胞活力下降，搏動頻率減慢，細胞ROS含量、LDH漏出量、細胞凋亡率及p-p38 MAPK的水平均較N組顯著增加(P<0.01)。經PFC預處理后，細胞搏動頻率、SOD活性及PKC、HSP70的水平較H/R 組顯著增加(P<0.05，)，p-p38 MAPK的水平和細胞凋亡率均減少(P<0.05)，而PFC的保護作用能被chelerythrine或SB203580抑制。結論: 山茱萸多糖可抑制心肌細胞缺氧/復氧損傷，其作用可能與增加SOD活性、抑制ROS產生、激活PKC并抑制p38MAPK的過度激活有關。

山茱萸； 多糖； 缺氧/復氧； 心肌細胞； 活性氧

許多研究表明蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)激活是缺血預處理中細胞保護信號傳導的中心環節[1]，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)可能也參與了缺血預處理對心肌的保護作用[2]。心肌缺血再灌注可誘發細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生增多，氧化應激水平升高，發生細胞損傷[3]。但有研究表明，氧化應激也可激活PKC和MAPKs信號轉導通路[4]。可見PKC和MAPKs信號轉導通路的激活在不同情況下可能會產生不同的作用。山茱萸多糖(polysaccharide fromFructuscorni，PFC)有強大的抗氧化能力[5]。我們前期研究也證實PFC可以抑制心肌缺血再灌注損傷，其機制與顯著的抗氧化性有關。本研究分離原代乳鼠心肌細胞，建立缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)模型模擬在體心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)的病變過程，并選用特異性通路抑制劑，從細胞水平觀察PFC對心肌細胞缺氧復氧損傷的作用，探討其對ROS/PKC/p38MAPK途徑的影響。

材 料 和 方 法

1 動物

清潔級SD大鼠，出生1 d之內，雌雄不限。

2 主要試劑

山茱萸多糖由本實驗室自制，經硫酸-苯酚法測定其多糖含量為81%。高糖DMEM培養基購自Gibco；胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司；所用Ⅰ抗均購自Abcam；chelerythrine chloride和SB203580購自LC Laboratories；Western blotting所用相關試劑和Hoechst 33258均購自碧云天生物技術有限公司；ROS、SOD和LDH測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；厭氧產氣袋購自上海新睿生物科技有限公司。

3 方 法

3.1 原代心肌細胞的分離、培養[6]應用胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶分離心肌組織，采用差速貼壁法，去除先貼壁的非心肌細胞，將尚未貼壁的心肌細胞懸液，調整細胞濃度為5.5×108/L，加入終濃度為0.1 mmol/L的BrdU，移入12孔培養板中培養48 h后換液以備后續實驗。

3.2 心肌細胞純度鑒定 取培養72 h心肌細胞爬片，PBS沖洗3次，-20 ℃冰丙酮固定20 min，α-actinⅠ抗37 ℃孵育3 h，辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗孵育1 h，DAB顯色。

3.3 H/R損傷模型的建立及分組 將心肌細胞分為7組，每組3個復孔：①正常對照組(normal，N)；② 缺氧/復氧組(H/R)：在密閉的小空間內放入厭氧產氣袋，待指示劑變色后開始計時，缺氧1 h，95% O2、5% CO2復氧2 h；③～⑤ PFC預處理組：提前24 h各孔加入PFC，其終濃度分別為20、100和200 mg/L(依次命名為PFC1+H/R、PFC2+H/R和PFC3+H/R組)，然后進行第②組的步驟；⑥ 在PFC(100 mg/L)預處理前用chelerythrine(1 μmol/L)與細胞孵育30 min后，再進行PFC預處理操作，即為CHE+PFC2+H/R組；⑦ 在PFC(100 mg/L)預處理前用SB203580(10 μmol/L)與細胞孵育30 min后，再進行PFC預處理操作，即為SB+PFC2+H/R組。

3.4 心肌細胞活力和凋亡率 心肌細胞培養72 h，每孔任意5個視野鏡下計數細胞的搏動頻率。4%多聚甲醛固定細胞爬片30 min，PBS清洗，加Hoechst 33258(1 mg/L)37℃孵育20 min，封片，熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況，以每個視野凋亡細胞數/細胞總數×100%為凋亡率。

3.5 LDH漏出量、ROS含量及SOD活性 復氧結束后，吸取細胞上清液羥胺法測定SOD活性，微板法測定LDH漏出量，裂解細胞，化學熒光法測定ROS含量，操作步驟嚴格按說明書進行，以上指標均在多功能酶標儀上(TECAN)檢測。

3.6 Western blotting分析PKC、p-p38和HSP70的蛋白表達水平 冰上裂解細胞，蛋白定量，蛋白電泳后轉移到NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后加入PKC、p-p38、HSP70Ⅰ抗，4 ℃過夜，次日與堿性磷酸酶偶聯的Ⅱ抗(Promega)雜交，Western blue(Promega)顯色。采用Image-Pro Plus 7.0圖像分析軟件測定目的蛋白條帶的灰度值，計算與內參照GAPDH條帶灰度值的比值。

4 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行數據分析。數據均用均數±標準差(mean±SD)表示，組間數據采用單因素方差分析，以P<0. 05為差異有統計學意義。

結 果

1 原代心肌細胞的形態及純度鑒定

培養6 h后細胞開始貼壁，24 h后已有心肌細胞伸出偽足，形態多樣，培養72 h后，細胞成簇生長，出現明顯節律性搏動。細胞爬片α-actin免疫組化染色陽性細胞達95%以上，見圖 1。

Figure 1.Culture and identification of neonatal rat primary cardiomyocytes. A: primary cardiomyocytes cultured for 24 h (×200); B: primary cardiomyocytes cultured for 72 h (×200); C: identification of cardiomyocytes by immunohistochemistry for the cardiac-specific α-actin (×400).

圖1 原代培養乳鼠心肌細胞的培養及鑒定

2 心肌細胞搏動頻率

倒置顯微鏡下觀察N組細胞成簇生長，折光性良好，搏動明顯且規律；H/R組細胞折光性下降，偽足縮短或消失，與N組比較搏動頻率明顯下降(P<0.01)； 給予PFC(20、100和200 mg/L)后，各組細胞折光性良好，搏動有力且規律，搏動頻率與H/R組相比有顯著差異(P<0.01)，且有一定的劑量依賴性；CHE+PFC2+H/R組細胞形態與H/R組相似，搏動頻率與H/R組接近；SB+PFC2+H/R組細胞生長狀態與CHE+PFC2+H/R組相似，搏動頻率明顯減慢，與H/R組相比無顯著差異(P>0.05)，見表1。

3 細胞凋亡百分率

經Hoechst 33258染色，熒光顯微鏡下N組細胞呈均勻彌散的藍色熒光，凋亡率僅為2.4%，而H/R組細胞熒光顏色不均勻，凋亡細胞出現明顯致密的強藍色熒光且呈塊狀聚積，其發生率達到38.3%，較N組明顯增高(P<0.01)；分別以濃度為20 mg/L、100 mg/L和200 mg/L的PFC預處理細胞后，細胞凋亡率分別為22.1%、10.7%和10.2%，與H/R 組相比凋亡率顯著降低(P<0.05)；而CHE+PFC2+H/R組與SB+PFC2+H/R組細胞凋亡率較PFC各組明顯升高(P<0.05)，與H/R組比較無顯著差異(P>0.05)，見圖2、表1。

表1 細胞搏動頻率及凋亡率的比較

Table 1.Comparison of apoptotic rates and beating frequencies in the rat cardiomyocytes with different treatments (Mean±SD.n=6)

GroupBeatingfrequency(min-1)Apoptoticrate(%)N96.0±6.62.4±0.6H/R27.7±5.1**38.3±6.8**PFC1+H/R82.5±6.3*##22.1±2.6**#PFC2+H/R94.4±7.4##10.7±2.4*##PFC3+H/R95.6±8.8##10.2±3.4*##CHE+PFC2+H/R25.3±5.3**30.9±8.9**SB+PFC2+H/R31.4±6.7**35.1±7.5**

TableP<0.05,**P<0.01vsN group;#P<0.05,##P<0.01vsH/R group.

Figure 2.Hoechst 33258 staining of neonatal rat cardiomyocytes (×100). A: normal group; B: H/R group; C: PFC1+H/R group; D: PFC2+H/R group; E: PFC3+H/R group; F: CHE+PFC2+H/R group; G: SB+PFC2+H/R group.

圖2 乳鼠心肌細胞Hoechst 33258染色

4 LDH漏出量和SOD活力

N組細胞生長狀態良好，細胞培養液LDH活性為404.32 U/L；H/R組細胞經過缺氧/復氧后膜通透性增高，培養液LDH活性顯著升高至924.01 U/L，與N組比較差異顯著(P<0.01)；以不同濃度PFC預處理后，其細胞培養液LDH活性均較H/R組降低(P<0.01)，且呈劑量依賴性；而CHE+PFC2+H/R組與SB+PFC2+H/R組LDH漏出量較PFC各組明顯升高(P<0.01)，與H/R組比較無顯著差異(P>0.05)。N組細胞培養液SOD活性為35.13×103U/L；H/R組培養液SOD活性顯著下降至17.45×103U/L，與N組比較差異顯著(P<0.01)；而PFC各組細胞培養液SOD活性均較H/R組升高(P<0.05)；CHE+PFC2+H/R組與SB+PFC2+H/R組SOD活性均較PFC各組顯著下降(P<0.01)，與H/R組比較無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 各組LDH漏出量和SOD活力的比較

Table 2.Comparison of LDH leakage and SOD activity in the rat cardiomyocytes with different treatments (Mean±SD.n=6)

GroupLDH(U/L)SOD(×103U/L)N404.32±22.3635.13±6.99H/R924.01±35.33**17.45±5.55**PFC1+H/R708.86±34.56**#25.29±4.65*#PFC2+H/R588.45±29.65**##33.35±6.04##PFC3+H/R583.67±28.31**##33.58±7.48##CHE+PFC2+H/R899.90±45.85**20.15±4.56**SB+PFC2+H/R901.02±39.16**19.21±5.91**

TableP<0.05,**P<0.01vsN group;#P<0.05,##P<0.01vsH/R group.

5 細胞ROS釋放量

把N組的熒光強度定為1，與N組相比，H/R組細胞內ROS 釋放量增加(P<0.01)；以不同濃度PFC預處理后，其細胞裂解液中的熒光強度較H/R組顯著下降(P<0.05)，但仍高于N組(P<0.05)；而CHE+PFC2+H/R組與SB+PFC2+H/R組細胞內ROS 釋放量較PFC各組明顯升高(P<0.01)，與H/R組比較無顯著差異(P>0.05)，見圖3。

Figure 3.ROS content in the rat cardiomyocytes with different treatments. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsN group;#P<0.05,##P<0.01vsH/R group.

圖3 心肌細胞的ROS含量

6 心肌細胞PKC、p-p38 MAPK和HSP70蛋白表達水平的變化

H/R損傷后，心肌細胞的HSP70和p-p38 MAPK均升高，與正常組相比差異顯著(P<0.01)，而PKC蛋白水平與正常組比較未見升高(P>0.05)；應用PFC(100 mg/L)后，HSP70和PKC的蛋白水平顯著升高，與H/R組比較差異顯著(P<0.01)，而p-p38 MAPK 較H/R組的水平下降(P<0.05)。CHE+PFC2+H/R組和SB+PFC2+H/R組的HSP70與PFC2+H/R組相比顯著下降，CHE+PFC2+H/R組的PKC蛋白水平較PFC2+H/R組顯著下降(P<0.01)，p38磷酸化水平也有降低(P<0.05)，表明PKC抑制劑chelerythrine對磷酸化p38表達水平也有影響。SB+PFC2+H/R組的HSP70和磷酸化p38水平較PFC2+H/R組顯著下降(P<0.01)，而PKC水平降低不明顯(P>0.05)，表明p38抑制劑SB203580對PKC蛋白表達的影響不明顯，見圖4。

討 論

心肌細胞缺氧導致能量代謝障礙，復氧后，氧自由基隨著大量氧的涌入產生增多，造成細胞損傷[7-8]。結合預實驗結果，本研究選擇PFC的實驗濃度為20、100 和200 mg/L。實驗以細胞培養液中LDH漏出量作為心肌細胞損傷的指標。結果顯示，H/R組細胞培養液中LDH漏出量明顯增加，而PFC各劑量組均可減少H/R后培養液中LDH漏出量，尤以100 和200 mg/L PFC組顯著，表明PFC各劑量組均可減輕細胞膜的損傷。

Figure 4.The protein levels of PKC, p-p38 and HSP70 in the rat cardiomyocytes detected by Western blotting. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsN group;#P<0.05,##P<0.01vsH/R group.

圖4 心肌細胞PKC、p-p38和HSP70蛋白的表達

SOD可清除氧自由基，其值高低反映了機體清除氧自由基的能力[9]。實驗結果表明，H/R組ROS含量明顯增高，SOD的活力降低，心肌細胞形態發生變化，活力下降，而PFC各劑量組均可明顯增強SOD的活力，降低細胞ROS量，提高細胞活力，也以100 和200 mg/L PFC組顯著，說明PFC可通過增強細胞清除氧自由基的能力發揮對心肌細胞H/R損傷的保護作用。細胞凋亡也是心肌細胞H/R損傷的一種表現[10]，實驗中用Hoechst 33258染色細胞，熒光顯微鏡下測定表明PFC各劑量組均可降低缺氧復氧后心肌細胞凋亡率。

HSP70可參與胞內蛋白質的折疊和轉運以維持機體自身的穩定性，使細胞在應激狀態下能進行正常的生化反應和代謝[11]，屬應激狀態下產生的一種內源性保護蛋白。實驗中可以看到H/R組HSP70高于N組，濃度為100 mg/L PFC預處理后HSP70的表達量高于H/R組，說明PFC可以誘導HSP70的產生從而使心肌細胞耐受缺氧復氧損傷。

誘發細胞內ROS產生增多，致使氧化應激水平升高是缺血再灌注損傷的重要機制之一[12]。ROS作為信號分子可以影響多種信號轉導通路，如蛋白激酶C通路、JAK/STAT通路、MAPKs等信號轉導通路。它既可產生細胞損傷作用，同時也可誘導內源性抗氧化酶、誘導型一氧化氮合酶、HSP70等的表達，產生抗損傷效應[13]，可見ROS的作用是雙向的。有研究表明ROS可直接激活p38 MAPK通路，參與靶細胞損傷[14]。實驗中可以看到H/R組ROS明顯增多，PKC表達較正常組沒有明顯變化，而p-p38表達顯著增多，說明大量的ROS可以使p38過度激活，而PFC預處理可減少ROS的產生，同時PFC預處理組PKC的表達較H/R組增高，而p-p38的表達較H/R組下降，說明PFC可上調PKC的表達，抑制過強的氧化應激，減輕p-p38的過度激活。有研究認為MAPKs和HSPs等有可能作為PKC的底物介導了心臟缺血預處理的保護作用[4]。本研究實驗還觀察到應用PKC抑制劑后p38的表達下調，可見抑制PKC可以阻斷p38的表達，同時PFC的保護作用消失，而應用特異性的p38 MAPK信號轉導通路阻斷劑SB203580預處理后，PKC蛋白水平變化不大，也支持p38位于PKC的下游。然而阻斷PKC并不能完全阻斷p38，說明PKC可能只是p38上游信號分子之一。實驗中采用chelerythrine阻斷PKC活化及SB203580阻斷p38磷酸化，發現PFC的保護作用可被抵消，提示PKC及p38參與了PFC對H/R的保護作用。

綜上所述，PFC的抗心肌細胞H/R損傷作用的機制涉及PKC/p38 MAPK途徑，其可通過增加SOD活性，降低細胞內ROS含量，上調PKC 蛋白表達水平，阻止p38 MAPK的過度激活，誘導HSP70表達來發揮保護作用。

[1] Mitchell MB, Meng X, Ao L, et al. Preconditioning of isolated rat heart is mediated by protein kinase C[J]. Circ Res, 1995, 76(1):73-81.

[2] Zhang Y, Gu EW, Zhang J, et al. Role of p38 mitogen-activated protein kinases in cardioprotection of morphine preconditioning[J]. Chin Med J (Engl), 2007, 120(9):777-781.

[3] Raat NJ, Shiva S, Gladwin MT. Effects of nitrite on modulating ROS generation following ischemia and reperfusion[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2009, 61(4):339-350.

[4] Otani H. Reactive oxygen species as mediators of signal transduction in ischemic preconditioning[J]. Antioxid Redox Signal， 2004, 6(2):449-469.

[5] 李 平, 王艷輝, 馬潤宇. 山茱萸多糖 PFCAⅢ的理化性質及生物活性研究[J]. 中國藥學雜志, 2003, 38(8):583-586.

[6] 張曉京, 張建棟, 來麗娜，等. SD乳鼠原代心肌細胞培養方法的改進[J]. 長治醫學院學報, 2012, 26(3):171-173.

[7] Mu YL, Xie YY, Zhou L, et al. Cardioprotective effect of ‘methylamine irisolidone’, a new compound, in hypoxia/ reoxygenation injury in cultured rat cardiacmyocyte[J]. Chem Biodivers, 2009, 6(8):1170-1177.

[8] Elizabeth D, Danz B, Skramsted J, et al. Resveratrol prevents oxorubicin cardiotoxicity through mitochondrial stabilization and the Sirt1 pathway[J]. Free Rad Biol Med, 2009, 46(12):1589-1597.

[9] 喻守佳，王海英，喻 田，等. Nrf2-ARE 通路在缺氧/吡那地爾后處理減輕大鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷中的作用[J]. 中國病理生理雜志，2013, 29(9):1696-1699.

[10]湯 蕾，彭易安，胥甜甜, 等. PKCε信號通路介導槲皮素拮抗心肌細胞缺氧/復氧損傷[J]. 中國病理生理雜志，2013，29(9): 1567-1572.

[11]Coaxum SD, Griffin TM, Martin JL, et al. Influence of PKC-alpha overexpression on HSP70 and cardioprotection[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2007, 292(5):H2220-H2226.

[12]Gao Q, Yang B, Ye ZG, et al. Opening the calcium-activated potassium channel participates in the cardioprotective effect of puerarin[J]. Eur J Pharmacol, 2007, 574( 2-3):179-184.

[13]Alvarez-Jaimes L, Feliciano-Rivera M, Centeno-González M, et al. Contributiom of the mitogen-activated protein kinase and protein kinase C cascades in spatial learning and memory mediated by the nucleus accumbens[J]. J Pharmcol Exp Ther, 2005, 314(3):1144-1157.

[14]Kumphune S, Chattipakorn S, Chattipakorn N. Role of p38 inhibition in cardiac ischemia/reperfusion injury[J]. Eur J Clin Pharmacol, 2012, 68(5):513-524.

Role of ROS/PKC/p38 MAPK pathway in protective effects of polysaccharide fromFructuscornion rat cardiomyocytes against hypoxia-reoxygenation injury

LAI Li-na, SONG Li-hua, ZHANG Xiao-jing, ZHANG Xiao-yi, LEI Jing-wen, LIU Fang, GUO Chun-hua, SONG Xiao-liang

(DepartmentofPharmacology,ChangzhiMedicalCollege,Changzhi046000,China.E-mail:songxiaoliang62@sina.com)

AIM: To investigate the effect of polysaccharide fromFructuscorni(PFC) on cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation (H/R) injury and its possible relationship with ROS/PKC/p38 MAPK pathway.METHODS: Primary cardiomyocytes were isolated from neonatal SD rats and randomly divided into normal group, H/R group, PFC (20 mg/L, 100 mg/L and 200 mg/L) preconditioning+H/R groups, chelerythrine+PFC (100 mg/L)+H/R group and SB203580+PFC (100 mg/L)+H/R group. The cell viability was measured by inverted microscopic observation. Apoptosis in the cardiomyocytes was detected by Hoechst 33258 staining and fluorescence microscopy. The levels of lactate dehydrogenase (LDH) and superoxide dismutase (SOD) in the cell culture supernatants, and the reactive oxygen species (ROS) in the cells were also measured by microplate reader. The protein levels of PKC, p-p38 MAPK and HSP70 in the cells were detected by Western blotting.RESULTS: Compared with normal group, the cell viability and beating frequency were decreased in H/R group. LDH and ROS contents, apoptotic rate and p-p38 MAPK level increased significantly (P<0.01). Compared with H/R group, PFC preconditioning increased beating frequency, SOD activity and the protein level of PKC and HSP70, and decreased ROS production， the protein level of p-p38 MAPK and cell apoptotic rate. However, the effect of PFC was inhibited by chelerythrine or SB203580.CONCLUSION: PFC may protect cardiomyocytes from hypoxia/reoxygenation injury. Its mechanism is possibly involved in the inhibition of ROS via increasing the activity of SOD and the activation of PKC, and suppression of excessive activation of p38 MAPK.

Fructuscorni; Polysaccharide; Hypoxia/reoxygenation; Cardiomyocytes； Reactive oxygen species

1000- 4718(2014)12- 2201- 05

2014- 08- 14

2014- 09- 11

山西省高校重點學科建設項目(No.20131007)；山西省高等學校“131”領軍人才工程項目(No.604)

R285.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.015

△通訊作者 Tel: 0355-3151036; E-mail： songxiaoliang62@sina.com