小檗堿與育亨賓對膿毒癥小鼠脾細胞凋亡的影響及其機制研究*

賈寶銀， 楊多猛， 王 媛， 李紅梅， 余小慧， 呂秀秀， 陸大祥， 王華東

(暨南大學醫學院病理生理學系，國家中醫藥管理局三級科研實驗室，廣東 廣州 510632)

小檗堿與育亨賓對膿毒癥小鼠脾細胞凋亡的影響及其機制研究*

賈寶銀， 楊多猛， 王 媛， 李紅梅， 余小慧， 呂秀秀， 陸大祥， 王華東△

(暨南大學醫學院病理生理學系，國家中醫藥管理局三級科研實驗室，廣東 廣州 510632)

目的： 探討小檗堿與育亨賓對膿毒癥小鼠脾細胞凋亡的影響及其作用機制。方法: 采用盲腸結扎穿孔(CLP)構建小鼠膿毒癥模型，分為假手術(sham)組、CLP組、CLP+小檗堿組、CLP+育亨賓組、CLP+小檗堿與育亨賓合劑組。CLP術后2 h灌胃給予相應藥物，20 h后取脾臟，用TUNEL和流式細胞術檢測小鼠脾細胞凋亡，酶熒光法檢測caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性變化，Western blotting檢測凋亡相關蛋白Fas、Bim、Bcl-2和Bax的表達。結果: (1) CLP組脾臟TUNEL陽性細胞百分率顯著高于sham組(P<0.05)，CLP+育亨賓與小檗堿合劑組、CLP+育亨賓組凋亡細胞百分率顯著低于CLP組(P<0.05)。(2) 流式細胞儀檢測顯示CLP組凋亡的脾細胞及T淋巴細胞明顯多于sham組(P<0.05)，CLP+育亨賓與小檗堿合劑組、CLP+育亨賓組凋亡的脾細胞及T淋巴細胞明顯少于CLP組 (P<0.05) 。(3) CLP+育亨賓與小檗堿合劑組、CLP+育亨賓組脾細胞caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性均低于CLP組(P<0.05)；而CLP+小檗堿組脾細胞caspase-9活性也低于CLP組 (P<0.05)。(4) CLP+育亨賓與小檗堿合劑組胞漿Fas、Bim、Bax表達均低于CLP組，CLP+育亨賓組胞漿Fas表達低于CLP組，CLP+小檗堿治療組胞漿Bim、線粒體Bax表達均低于CLP組。結論: (1) 小檗堿與育亨賓合用可通過阻斷內、外源性凋亡途徑抑制膿毒癥小鼠脾細胞凋亡，特別是T淋巴細胞凋亡。(2) 育亨賓主要通過抑制Fas的表達、進而阻斷內、外源性凋亡途徑減少膿毒癥誘導的脾細胞凋亡。(3) 小檗堿可抑制膿毒癥小鼠脾細胞線粒體凋亡途徑，但對膿毒癥小鼠脾細胞凋亡的抑制作用并不明顯。

小檗堿； 育亨賓； 細胞凋亡； 膿毒癥； 脾淋巴細胞

膿毒癥是重癥監護室(intensive care unit, ICU)病人死亡的重要原因之一[1]，膿毒癥病人在膿毒癥后期常常出現嚴重的免疫抑制，容易發生醫院內二次感染[2]。目前的研究顯示，大量的淋巴細胞凋亡導致機體抗感染能力降低以及免疫功能障礙、繼而引發院內感染是膿毒癥患者后期死亡的重要原因[3]。然而，目前臨床治療膿毒癥的主要方法仍然是應用抗生素治療相關感染以及血液動力學和器官支持等對癥治療。因此，尋求一種有效抑制膿毒癥患者淋巴細胞凋亡的方法，對于改善膿毒癥病人的免疫抑制狀況和預后尤為重要。我們前期研究發現小檗堿(berberine, B)和α2-腎上腺素能受體(α2-adrenoceptor, α2-AR)阻斷劑育亨賓(yohimbine,Y) 聯合應用可顯著降低膿毒癥小鼠的死亡率[4]，但是小檗堿和育亨賓聯用是否能抑制膿毒癥誘導的淋巴細胞凋亡？其機制如何？迄今尚缺乏深入的研究。因此，本研究觀察小檗堿和育亨賓對膿毒癥小鼠脾淋巴細胞凋亡的影響，并進一步研究其作用的分子機制，為闡明小檗堿和育亨賓聯合應用治療膿毒癥的機制提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 實驗動物與分組

清潔級雄性C57BL/6小鼠，購自廣東省醫學實驗動物中心，合格證編號為SCXK(粵)2008-0002:44007200005475，8～10周齡，體重20～25 g之間。小鼠每籠5只，分籠飼養于暨南大學動物實驗中心，自由進食及飲水。待其適應環境1周后進行后續實驗。飼養與實驗環境溫度控制在(25 ±2) ℃，濕度控制在60%～80%。小鼠進行分組處理：假手術組(sham組)，術后2 h用超純水(0.1 mL/10 g體重)灌胃；膿毒癥模型組，即盲腸結扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP )組，CLP術后2 h用超純水(0.1 mL/10 g體重)灌胃；CLP+小檗堿組(CLP+B)，術后2 h用小檗堿(50 mg/kg，0.1 mL/10 g體重)灌胃；CLP+育亨賓組(CLP+Y)，術后2 h用育亨賓(2 mg/kg，0.1 mL/10 g體重)灌胃；CLP+小檗堿與育亨賓合劑組(CLP+BY)，術后2 h用小檗堿(50 mg/kg)與育亨賓(2 mg/kg)配制成BY合劑(0.1 mL/10 g體重)灌胃。所有實驗過程符合暨南大學醫學院實驗動物倫理規定的要求。

2 主要試劑

中性硫酸小檗堿、育亨賓均購自Sigma；TUNEL試劑盒購自Roche；凋亡檢測試劑盒：Annexin V-FITC Apoptosis detection Kit、T淋巴細胞特異性表面流式抗體Anti-Mouse CD3e APC、B淋巴細胞特異性表面流式抗體Anti-Human/Mouse CD45R PE-Cy7、封閉抗體Anti-Mouse CD16/32 Purified(FcR Block)均購自eBioscience；Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay Kit購自Promega；Caspase-8/FLICE Fluorometric Assay Kit、Caspase-9 Fluorometric Assay Kit均購自BioVision；線粒體提取試劑盒Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells、兔抗小鼠 Fas Antibody購自Santa Cruz；兔抗小鼠 Bim Antibody、兔抗小鼠 Bax Antibody、兔抗小鼠 Bcl-2 Antibody、兔抗小鼠GAPDH Antibody、兔抗小鼠VDAC Antibody均購自Cell Signaling。

3 主要方法

3.1 C57BL/6小鼠膿毒癥模型的建立 小鼠麻醉后，對其腹部皮膚手術區進行消毒，沿腹白線行正中切口，開腹后，小心分離并提拉盲腸置于洞巾上，避開腸系膜大血管于盲腸末端約2/3處結扎盲腸，以12號針貫穿盲腸，來回穿刺5次，注意穿孔時避開腸壁血管，回納腸管，依次關腹縫合，手術切口消毒，對合切口兩側邊緣腹壁與皮膚。術后在小鼠背部皮下注射無菌生理鹽水(0.3 mL /10 g)。

3.2 脾組織冰凍切片制備及TUNEL染色 術后20 h麻醉并處死小鼠，將脾臟組織置于4%多聚甲醛中固定24 h。再用冰PBS液沖洗后依次放于10%蔗糖溶液6 h，20%蔗糖溶液過夜，30%蔗糖溶液24 h進行脫水，PBS清洗組織后置于包埋盒中，加入OCT膠，調節切片厚度為5 μm，使用冰凍切片機，將組織塊修整后切片。用防脫載玻片貼取組織切片放于37 ℃烤箱，12 h后將組織載玻片置于濕盒中，用0.3% PBST液室溫孵育5 min，重復3次穿孔破膜，使用5% BSA室溫孵育30 min進行封閉。PBST洗片3次后每張玻片上加125 μL TUNEL工作液，使其全部覆蓋樣本，37 ℃避光孵育1 h。PBST洗片3次， DAPI染核并滴加抗熒光淬滅劑，將蓋玻片蓋在載玻片上后做好標記，在蓋玻片周圍封指甲油，選取所需要的熒光通道，以及適合的激發波長，激光共聚焦顯微鏡觀察。

3.3 脾臟T淋巴細胞、B淋巴細胞凋亡染色 CLP術后20 h，麻醉后處理小鼠，無菌取出脾臟立即放入盛有適量預冷的10% FCS RPMI-1640液中，運用沖洗法將脾細胞沖出并用200目濾網過濾，去除雜質，使用碧云天ACK紅細胞裂解液裂解紅細胞，用1 mL新鮮含10% FCS的RPM-I1640液重懸細胞，并細胞計數。調整細胞數為1.5×1010/L。從上述細胞懸液取200 μL，加入封閉抗體anti-mouse CD16/32，冰上孵育5～10 min后加入anti-mouse CD3e APC、anti-mouse CD45R PE-Cy7抗體混合液孵育抗體，4 ℃避光孵育30 min。保持細胞密度為2×108～5×108/L，離心去上清。加5 μL Annexin V及1 × binding buffer 195 μL,輕微吹打混勻后，室溫避光孵育10 min。用1× binding buffer 200 μL洗去殘留的Annexin V。再加1 × binding buffer 190 μL及10 μL PI，重懸后立即使用流式細胞儀檢測。

3.4 脾細胞caspase-3、8、9活性測定 術后20 h處死小鼠，將1 mL脾細胞懸液每樣本分為500 μL、250 μL、250 μL以分別測定caspase-3、8、9的活性。Caspase活性檢測分別按照說明書依次檢測，多功能酶標儀測定熒光值相對熒光單位(relative fluorescence units,RFU )。同時分別測定樣品的蛋白濃度。

3.5 Western blotting檢測脾細胞Fas、Bcl-2、Bim的表達以及線粒體Bax水平 術后20 h處死小鼠，制備脾細胞懸液，并應用線粒體試劑盒進行線粒體分離。然后將胞漿蛋白加入5 × loading buffer加熱變性；而線粒體沉淀加入70 μL RIPA裂解液裂解之后加入5 × loading buffer加熱變性。其中，胞漿蛋白用來檢測Fas、Bim和Bcl-2，線粒體蛋白用來檢測Bax。運用SDS凝膠電泳，采用恒流(35 mA/凝膠)電泳，根據蛋白分子量確定電泳時間，如小分子蛋白電泳時間最好30 min以內，20 kD以上蛋白電泳在30～40 min。轉膜條件：18 V，7 min(蛋白分子量>20 kD)；15 V，6 min(蛋白分子量<20 kD)。GAPDH作為胞漿蛋白內參照，線粒體蛋白內參照是VDAC。電泳后切取所需目的蛋白及內參照蛋白膠條，進行轉膜、封閉、洗膜、抗體孵育、經過化學發光、顯影、定影，用凝膠圖像處理系統分析目標條帶的灰度值。

4 統計學處理

所有實驗數據使用均數±標準誤(mean±SEM)表示，經SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析，多組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，各組方差齊時，兩兩組間比較采用LSD法；各組方差不齊時，兩兩比較用Tamhane’s T2法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 TUNEL檢測結果

術后20 h小鼠脾臟冰凍切片TUNEL染色，經激光共聚焦顯微鏡觀察，各組結果如圖1所示。藍色為脾細胞核，綠色為TUNEL陽性細胞，二者重合代表細胞發生凋亡。對凋亡細胞進行統計，CLP術后20 h，脾臟組織凋亡細胞數明顯高于假手術組(P< 0.05)，CLP+Y組、CLP+BY組脾細胞凋亡數顯著低于CLP組(P< 0.05)，而CLP+B組與CLP組相比，脾細胞凋亡計數差異無統計學意義(P>0.05)。

Figure 1.Effects of berberine (B) or/and yohimbine (Y) on sepsis-induced splenocyte apoptosis in C57BL/6 mice. Splenocyte apoptosis was detected by TUNEL 20 h after CLP. Mean ±SEM.n=10～12.*P<0.05vssham；#P<0.05vsCLP.

圖1 小檗堿和(或)育亨賓對膿毒癥術后20 h小鼠脾細胞凋亡的影響

2 小鼠脾臟T淋巴細胞、B淋巴細胞凋亡流式細胞儀檢測結果

從圖可以看出，CLP術后20 h， CLP組與假手術組相比，早期凋亡的脾細胞顯著增多(P<0.05)，CLP+Y組、CLP+BY組早期凋亡細胞的百分率均顯著低于CLP組(P<0.05)，而CLP+B組與CLP比較，早期凋亡細胞的百分率沒有統計學差異(P>0.05)。對T淋巴細胞早期凋亡百分數進行統計學分析，CLP術后20 h， CLP組早期凋亡T淋巴細胞的百分率顯著高于假手術組(P<0.05)，CLP+Y組、CLP+BY組分別與CLP組比較，早期凋亡的T淋巴細胞均明顯減少(P<0.05)，而CLP+B組與CLP比較，早期凋亡的T淋巴細胞百分率沒有統計學差異(P>0.05)。CLP術后20 h， CLP組早期凋亡的脾臟B淋巴細胞顯著多于假手術組(P<0.05)；CLP+Y組與CLP組比較，早期凋亡的B淋巴細胞明顯減少(P<0.05)，而CLP+B組、CLP+BY組分別與CLP組比較，早期凋亡的B淋巴細胞百分率沒有統計學差異(P>0.05)。

Figure 2.Effects of berberine(B)or/and yohimbine(Y)on sepsis-induced splenocyte, T and B lymphocyte apoptosis in C57BL/6 mice. Lymphocyte apoptosis 20 h after CLP or sham operation was detected by flow cytometric analysis using staining with Annexin V-FITC/PI. Mean± SEM.n=12～15.*P<0.05vssham；#P<0.05vsCLP.

圖2 小檗堿和(或)育亨賓對膿毒癥小鼠脾細胞及脾T和B淋巴細胞凋亡的影響

3 各組小鼠脾細胞caspase-3、8和9活性的變化

由圖3可以看出，CLP組與假手術組比較，caspase-3活性顯著增高，差異有統計學意義(P<0.05)。 CLP+Y組、CLP+BY組分別與CLP組比較，caspase-3活性均顯著降低(P<0.05),而CLP+B組與CLP組比較，caspase-3活性沒有統計學差異(P>0.05)。CLP組與假手術組比較，脾細胞caspase-8的活性顯著升高(P<0.05)；CLP+Y組、CLP+BY組分別與CLP組比較，caspase-8酶活性均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。而CLP+B組與CLP組比較，脾細胞caspase-8的活性沒有統計學差異(P>0.05)。 術后20 h，CLP組脾細胞caspase-9的活性明顯高于假手術組(P<0.05)，CLP+Y組、CLP+BY組、CLP+B組分別與CLP組比較，脾細胞caspase-9的活性均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。

Figure 3.Effects of berberine (B) or/and yohimbine (Y) on caspase-3, caspase-8 and caspase-9 activities of splenocytes in C57BL/6 mice at 20 h after CLP. Mean±SEM.n=12～15.*P<0.05vssham；#P<0.05vsCLP.

圖3 小檗堿和(或)育亨賓對膿毒癥小鼠脾細胞caspase-3、8和9活性的影響

4 各組小鼠脾細胞Fas、Bcl-2、Bim的表達及線粒體Bax水平的變化

從圖4可以看出，C57BL/6小鼠在復制膿毒癥模型20 h后，脾細胞Fas蛋白表達明顯高于假手術組(P<0.05)。CLP+Y組、CLP+BY組脾細胞Fas蛋白的表達均低于CLP組(P<0.05)，而CLP+B組的Fas蛋白表達與CLP組比較沒有統計學差異(P>0.05)。CLP組與假手術組相比，Bim表達量顯著增加(P<0.05)。CLP+B組、CLP+BY組Bim表達量均明顯低于CLP組(P<0.05)，而CLP+Y組與CLP組相比，Bim表達沒有顯著差異(P>0.05)。CLP術后20 h，小鼠脾細胞Bcl-2 的表達顯著低于假手術組(P<0.05)。應用小檗堿和(或)育亨賓治療的CLP小鼠，CLP術后20 h脾細胞內Bcl-2 表達量與CLP組相比沒有統計學差異(P>0.05)。CLP組脾細胞線粒體Bax蛋白含量與假手術組相比顯著增高(P<0.05)。CLP+B組、CLP+BY組的脾細胞線粒體Bax蛋白含量均明顯低于CLP組(P<0.05)；CLP+Y組的脾細胞線粒體Bax蛋白含量與CLP組相比沒有統計學差異(P>0.05)。

討 論

膿毒癥是一種感染引起的全身性炎癥反應綜合征[5]。雖然臨床治療措施不斷改進，但是膿毒癥患者的死亡率一直居高不下，因此膿毒癥仍是極具挑戰性的臨床問題[5-6]。通常, 膿毒癥患者的免疫功能受損，尤其在膿毒癥后期，可出現脾臟與胸腺等器官淋巴細胞凋亡[7-8]。研究發現，膿毒癥時 T淋巴細胞、B淋巴細胞等免疫細胞的凋亡嚴重影響患者的預后[9]。因此，通過某種手段調節膿毒癥患者淋巴細胞凋亡將是具有價值的治療方法。

我們先前研究發現，小檗堿與育亨賓聯合應用能顯著降低膿毒癥小鼠的死亡率[4]。本研究采用CLP復制膿毒癥模型，術后20 h觀察這些藥物對脾細胞凋亡的影響。結果發現，膿毒癥術后20 h小鼠脾細胞出現明顯凋亡，包括T、B淋巴細胞；單用育亨賓、育亨賓與小檗堿合劑均能明顯抑制膿毒癥引起的小鼠脾細胞凋亡、特別是T淋巴細胞凋亡。而單用小檗堿，并不能顯著抑制膿毒癥引起的脾細胞凋亡，也不能抑制膿毒癥誘導的T、B淋巴細胞凋亡。同時，我們還發現，單用育亨賓可以抑制膿毒癥誘導的B淋巴細胞凋亡。研究已經證實，淋巴細胞上存在α2腎上腺素能受體，育亨賓能阻斷α2腎上腺素能受體的活化[10]。這些結果提示, 淋巴細胞上α2腎上腺素能受體可能直接或間接調節膿毒癥誘導的淋巴細胞凋亡，阻斷α2腎上腺素能受體活化可能是抑制膿毒癥患者淋巴細胞凋亡的一種新策略。

很多研究表明，死亡受體(外源性)途徑和線粒體(內源性)途徑均參與了膿毒癥誘導的淋巴細胞凋亡。例如，Fas蛋白可介導膿毒癥誘導的CD4+T淋巴細胞凋亡[11]；Schwulst等[12]發現抑制bim基因的表達可阻斷膿毒癥誘導的淋巴細胞凋亡，顯著改善存活。此外，bcl-2轉基因小鼠的脾淋巴細胞凋亡可以完全被抑制[13]；IL-15可阻止NK細胞、樹突細胞、CD8+T細胞的凋亡，并上調細胞內抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，同時下調促凋亡蛋白Bim和PUMA的表達，提高膿毒癥小鼠的生存率[14]。本研究進一步探討了育亨賓和小檗堿對膿毒癥小鼠脾細胞凋亡的作用機制。結果顯示，膿毒癥小鼠脾細胞Fas的表達明顯上調，caspase-8的活性明顯升高；同時，膿毒癥小鼠脾細胞中Bim的表達上調、Bcl-2表達下調，線粒體Bax水平明顯升高，脾細胞caspase-9活性增強。這些結果說明，膿毒癥誘導脾細胞凋亡的發生機制與內、外源性凋亡途徑有關。育亨賓單用可以顯著降低膿毒癥小鼠脾細胞中Fas的表達，并且caspase-8和caspase-3活性也顯著降低，說明育亨賓可能通過作用于外源性凋亡途徑發揮抗膿毒癥淋巴細胞凋亡的作用。有趣的是，單用育亨賓后，膿毒癥小鼠脾細胞caspase-9的活性也顯著降低，但是育亨賓并不能抑制膿毒癥誘導的脾細胞Bim的表達，也不能降低膿毒癥小鼠脾細胞線粒體中Bax的水平，這可能是育亨賓在小鼠體內通過抑制caspase-8裂解Bid，從而導致caspase-9的活性顯著降低。單用小檗堿后，膿毒癥小鼠脾細胞Bim表達下調、線粒體Bax蛋白的含量降低，且caspase-9的活性也相應降低，但是對Fas蛋白的表達和caspase-8及caspase-3活性沒有顯著影響。這些結果提示：小檗堿僅僅抑制細胞內源性凋亡途徑，對外源性凋亡途徑沒有影響，但總體上并不足以抑制膿毒癥誘導的脾細胞凋亡。

Figure 4.The effects of berberine (B) or/and yohimbine (Y) on Fas, Bim, Bcl-2 expression and mitochondrial Bax content of splenocytes in C57BL/6 mice at 20 h after subjected to CLP. Mean±SEM.n=12～15.*P<0.05vssham;#P<0.05vsCLP. GAPDH was used as the cytoplasm reference protein and voltage-dependent anion channel protein (VDAC) was used as the mitochondrial reference protein.

圖4 小檗堿和(或)育亨賓對膿毒癥小鼠脾細胞胞漿Fas、Bim、Bcl-2表達及線粒體Bax含量的影響

雖然，Chang等[15]發現在膿毒癥引起的淋巴細胞凋亡中，內、外源性2條凋亡途徑的交叉作用確實扮演了極其重要的角色， 但目前并沒有確定內、外源性凋亡途徑在膿毒癥引起的脾細胞凋亡中發揮作用的程度。我們的研究發現，育亨賓單用可以顯著降低膿毒癥小鼠脾細胞中Fas的表達、caspase-8和caspase-3的活化和脾細胞凋亡，而小檗堿能抑制膿毒癥引起的脾細胞caspase-9的活化，但不能顯著抑制膿毒癥引起的脾細胞caspase-3的活化和脾細胞凋亡。 這些結果提示，在膿毒癥引起的脾細胞凋亡中，外源性凋亡途徑(Fas的表達)的活化可能發揮更大程度的作用。

我們進一步觀察發現，小檗堿與育亨賓合用后能顯著抑制膿毒癥小鼠脾細胞凋亡，不但能顯著降低Fas的表達，而且顯著降低Bim的表達、減少線粒體Bax的含量，顯著降低caspase-8、9、3的活化，因而小檗堿與育亨賓合劑可能同時通過作用于內、外源性兩條凋亡途徑抑制膿毒癥脾細胞的凋亡。

盡管本研究初步探討了小檗堿與育亨賓發揮抗膿毒癥淋巴細胞凋亡的作用機制， 但是本研究尚存在很多不足之處。例如，本研究僅限于內、外源性凋亡途徑，而且2條途徑的信號分子研究也不全面；膿毒癥淋巴細胞的凋亡還涉及其它途徑的作用，體內給予α2腎上腺素能受體阻斷劑通過何種環節抑制膿毒癥誘導的淋巴細胞凋亡，尚未闡明。因此，這些藥物作用的具體機制還有待進一步研究。

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Effects of berberine and yohimbine on splenocyte apoptosis in septic mice

JIA Bao-yin, YANG Duo-meng, WANG Yuan, LI Hong-mei, YU Xiao-hui, Lü Xiu-xiu, LU Da-xiang, WANG Hua-dong

(DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,KeyLaboratoryofPathophysiology,StateAdministrationofTraditionalChineseMedicineofThePeople’sRepublicofChina,Guangzhou510632,China.E-mail:owanghd@jnu.edu.cn)

AIM: To observe the effects of berberine and yohimbine on splenocyte apoptosis in septic mice and underlying mechanisms. METHODS: The mice were subjected to cecal ligature and puncture (CLP). The drugs or vehicle were given intragastrically 2 h after the surgery according to the following 5 groups: sham, CLP, CLP+berberine, CLP+yohimbine, and CLP+berberine+yohimbine. The apoptosis of splenocytes stained by TUNEL was observed under laser scanning confocal microscope 20 h after CLP. The splenic lymphocytes were isolated and observed using flow cytometry. The activities of caspase-3, caspase-8 and caspase-9 in splenic lymphocytes were detected, and the expression of Fas, Bim, Bcl-2 and Bax in the splenocytes was also determined by Western blotting. RESULTS: The TUNEL staining showed that the apoptotic rate of the splenocytes in septic mice 20 h after CLP was significantly higher than that in sham and CLP+yohimbine groups (P<0.05). Compared with CLP group, the proportion of apoptotic cells was decreased in septic mice in CLP+berberine+yohimbine and CLP+yohimbine groups (P<0.05). Flow cytometry analysis demonstrated the similar results in the apoptosis of splenocytes and T lymphocytes. However, only yohimbine treatment reduced the apoptosis of B lymphocytes in the spleen of sepsis-challenged mice. Compared with CLP group, caspase-9 activity was significantly reduced in CLP+berberine group (P<0.05), the activities of caspase-3, caspase-8 and caspase-9 were all statistically reduced (P<0.05) in CLP+yohimbine group and CLP+yohimbine+berberine group. CLP significantly increased the expression of cytosolic Fas, Bim and mitochondrial Bax in the splenocytes, and decreased Bcl-2 expression compared with sham group. Compared with CLP group, the expression of cytosolic Bim and mitochondrial Bax in CLP+berberine group were reduced (P<0.05). Fas expression decreased only in CLP+yohimbine group (P<0.05). Berberine combined with yohimbine reduced the expression of cytosolic Fas, Bim and mitochondrial Bax in the septic mouse splenocytes (P<0.05).CONCLUSION: Yohimbine reduces sepsis-induced splenic lymphocyte apoptosis in mice by inhibiting Fas expression and in turn blocking both extrinsic and intrinsic apoptosis pathways. Berberine reduces Bim expression and inhibits caspase-9 activation, but not caspase-3 activation and apoptosis in the septic mouse splenocytes. Berberine combined with yohimbine reduces splenocyte apoptosis in the septic mice by inhibiting both extrinsic and intrinsic apoptotic pathways.

Berberine; Yohimbine; Apoptosis; Sepsis; Splenocytes

1000- 4718(2014)12- 2206- 07

2014- 09- 09

2014- 10- 30

國家自然科學基金資助項目(No.30971191； No.81170222)；廣東省自然科學基金重點項目(No.S2011020005408)；廣州市科技計劃項目(No.12C22071599)

R285.5； R163+.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.016

△通訊作者 Tel: 020-85220241; E-mail: owanghd@jnu.edu.cn