小檗堿對胰島β細胞的保護作用及其機制研究

吳惠玲

(淄博市第一醫院內分泌科，山東 淄博 255200)

小檗堿對胰島β細胞的保護作用及其機制研究

吳惠玲△

(淄博市第一醫院內分泌科，山東 淄博 255200)

目的： 探討小檗堿對胰島β細胞的保護作用及可能機制。方法: 采用四氧嘧啶(Axn)誘導INS-1胰島β細胞損傷模型，并以不同濃度的硫酸小檗堿進行干預。將細胞分為對照組(Con組)、損傷組(Axn組)、低劑量小檗堿組(LBer組，小檗堿濃度為15 μmol/L)、中劑量小檗堿組(MBer組，小檗堿濃度為45 μmol/L)及高劑量小檗堿組(HBer組，小檗堿濃度為100 μmol/L)。流式細胞術觀察各組細胞凋亡情況，Western blotting免疫印跡法分別觀察各組PTEN/PI3K/Akt信號通路、HNF-1α/PDX-1信號通路活化情況以及激活型caspase-3的水平；酶聯免疫吸附法(ELISA)觀察各組基礎胰島素釋放及葡萄糖刺激后胰島素的釋放水平。結果: 與Con組相比，Axn組凋亡率顯著升高，但小檗堿干預后凋亡水平顯著降低，且呈濃度依賴性。與Con組相比，Axn組PTEN表達水平明顯升高，而PI3K/Akt活性被抑制，激活型caspase-3水平顯著升高；而小檗堿處理則能逆轉上述PTEN通路的促凋亡作用，且顯示出濃度依賴性；與Con組相比，Axn組HNF-1α/PDX-1信號通路活性顯著下降，但小檗堿處理則能提高該通路活性，表現出濃度依賴性。與Con組相比，Axn組基礎及葡萄糖刺激下胰島素釋放水平均顯著降低，而小檗堿處理則能顯著恢復上述胰島素釋放水平，呈濃度依賴性。結論: 小檗堿對四氧嘧啶損傷的INS-1胰島β細胞具有保護作用，表現為對其凋亡的抑制與胰島素分泌功能的恢復，分別與影響細胞內PTEN/PI3K/Akt及HNF-1α/PDX-1信號通路有關。

小檗堿； β細胞； 細胞凋亡； 胰島素

在世界范圍內，糖尿病(diabetes mellitus, DM)是發病率僅次于心血管疾病及腫瘤的第三大非傳染性疾病，據世界衛生組織數據統計顯示，2010年時全球共有2.58億糖尿病患者，2012年該數字上升至3.71億，預計到2030年，全球將會有4.39億糖尿病患者[1]。作為一種慢性進展性代謝紊亂性疾病，糖尿病的致死及致殘率極高，在所有疾病中是僅次于感染性疾病、心血管疾病、惡性腫瘤以及創傷性疾病的第五大致死性病因。糖尿病系各種原因導致的胰島β細胞損傷及功能障礙引起的胰島素分泌水平下降引起，因此如何防治β細胞損傷并恢復其正常功能成為糖尿病治療的關鍵環節。小檗堿(berberine, Ber)是一種異喹啉類生物堿，主要存在于中藥黃連(CoptischinensisFranch.)以及云連(CoptisteetaWall.)等的根莖中[2]。近年來的研究表明小檗堿具有多種生物學活性，如抗炎、抗氧化以及抗增殖等，可影響多種細胞內信號轉導通路的活性。目前認為，小檗堿對糖尿病具有一定的治療作用，但具體機制尚未研究清楚。本研究以四氧嘧啶誘導體外培養的大鼠胰島β細胞株INS-1損傷模型，用小檗堿干預后觀察其對β細胞的保護作用并對其可能機制進行探討，為小檗堿在糖尿病中的治療價值提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

大鼠胰島素分泌β細胞株INS-1購自中國典型培養物保藏中心；硫酸Ber、四氧嘧啶(alloxan，Axn)和噻唑藍(MTT)購自Sigma；Annexin V-FITC流式凋亡檢測試劑盒購自BD；第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin ho-molog on chromosome ten，PTEN)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinsitol 3-kinase,PI3K)、肝臟細胞核因子1α(hepatocyte nuclear factor 1a,HNF-1α)以及胰腺十二指腸同源盒-1(pancreatic and duodenal homeobox 1,PDX-1)抗體均購自Abcam；蛋白激酶B (protein kinase B，Akt)以及磷酸化的Akt(p-Akt)抗體均購自CST；激活型caspase-3(cleaved caspase-3)以及GAPDH抗體購自Santa Cruz；大鼠胰島素ELISA試劑盒購自R&D。

2 細胞培養、處理及分組

INS-1細胞接種于含有10%胎牛血清(Gibco)以及青霉素-鏈霉素混合液的RPMI-1640培養基(Gibco)中，在5% CO2、37 ℃以及飽和濕度的培養環境下進行培養，視細胞生長情況每2～3 d進行一次換液，細胞貼壁生長占培養瓶瓶壁的90%左右時，可以1∶2～1∶3的比例進行傳代及分瓶培養。

將1×109/L的INS-1細胞懸液分為對照組(Con)、損傷組(Axn)、小檗堿低劑量組(LBer)、小檗堿中劑量組(MBer)以及小檗堿高劑量組(HBer)。Con組進行常規培養；Axn組培養基中加入終濃度為4 mmol/L的四氧嘧啶；LBer組培養基中加入終濃度為4 mmol/L的四氧嘧啶及終濃度為15 μmol/L的硫酸小檗堿溶液；MBer組培養基中加入終濃度為4 mmol/L的四氧嘧啶及終濃度為45 μmol/L的硫酸小檗堿溶液；HBer組培養基中加入終濃度為4 mmol/L的四氧嘧啶及終濃度為100 μmol/L的硫酸小檗堿溶液。上述各組細胞均在5% CO2、37 ℃以及飽和濕度的培養環境下進行72 h的培養。

3 主要實驗方法

3.1 MTT比色法測定細胞抑制率 稱取0.5 g MTT，溶于100 mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)中制成濃度為5 g/L的MTT溶液。將上述各組細胞懸液各200 μL接種于96孔板中，每組設6個復孔并設置調零孔及對照孔。在5% CO2、37 ℃以及飽和濕度的培養環境下進行72 h的培養。向每孔中加入20 μL上述MTT溶液并繼續培養4 h。棄去孔中培養液終止培養并向每孔中加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，低速搖床上充分振蕩10 min后在680型酶標儀(Bio-Rad)上讀取490 nm處的吸光度(A)值。細胞抑制率為存活細胞數占總細胞數的百分比。

3.2 Annexin V-PI雙染流式細胞術凋亡檢測 以胰酶在培養皿中對上述各組貼壁細胞進行消化，完全培養液終止消化后以1 000 r/min在室溫下離心5 min后棄去上清液，使用預冷的PBS充分洗滌并將各組細胞收集入EP管中。向各管中加入試劑盒中的binding buffer并將細胞懸液濃度調整為1×109/L。分別向各管中加入5 μL的Annexin V并在避光條件下室溫反應10 min，向各管中加入5 μL的PI并在避光條件下室溫反應5 min。再向各管中加入300 μL的binding buffer后將等量細胞轉移入Falcon管在FACScan流式細胞儀(BD)上對細胞凋亡進行檢測。

3.3 細胞胰島素釋放的檢測 將上述各組培養皿中細胞培養液棄去，以無血清的RPMI-1640培養基洗滌2～3次，加入KRB緩沖液(葡萄糖濃度2.8 mmol/L)培養2 h后收集上清；再向各組培養體系中加入KRB緩沖液(葡萄糖濃度16.7 mmol/L)培養2 h后收集上清。ELISA法對收集的各組上清液中胰島素含量進行檢測，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，最后在680型酶標儀上讀取450 nm的A值，并根據標準曲線對胰島素濃度進行計算。

3.4 Western blotting蛋白免疫印跡實驗 將上述各組培養皿中細胞培養液棄去，以預冷的PBS洗滌2～3次后收集各組細胞，以RIPA裂解液(ProMab)進行裂解，并加入終濃度為1 mmol/L的PMSF(Santa Cruz)。4 ℃下以12 500 ×g離心10 min獲得的上清即為總蛋白。采用BCA法對上述蛋白濃度進行檢測。將各組20 μg總蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進行垂直電泳后電轉印至PVDF膜。5%脫脂牛奶TBST溶液室溫下封閉90 min后，分別使用PTEN(1∶2 000)、PI3K(1∶2 000)、Akt(1∶2 000)、p-Akt(1∶1 000)、cleaved caspase-3(1∶1 000)、HNF-1α(1∶1 000)、PDX-1(1∶2 000)以及GAPDH(1∶500)抗體孵育，洗滌后再以辣根過氧化物酶(HRP)標記的Ⅱ抗(1∶2 000)進行孵育。TBST洗滌后以增強型ECL發光試劑盒對免疫印跡進行檢測與觀察。

4 統計學處理

采用統計學軟件SPSS 16.0分析。數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用One-way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 小檗堿對損傷胰島β細胞抑制率的影響

經MTT檢測發現，與Con組比，四氧嘧啶處理的胰島β細胞抑制率顯著升高；而小檗堿處理則能隨小檗堿濃度的升高顯著降低細胞抑制率，見圖1。

Figure 1.Comparison of the inhibitory rates among different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;##P<0.05vsAxn group;△P<0.05vsLBer group;▲P<0.05vsMBer group.

圖1 各組細胞抑制率的比較

2 小檗堿對損傷胰島β細胞凋亡的影響

經Annexin V-PI雙染流式細胞術檢測發現，四氧嘧啶處理能夠顯著促進INS-1細胞凋亡；而在小檗堿處理后，細胞凋亡率隨著藥物濃度的升高而呈現顯著降低,見圖2。

Figure 2.Comparison of the apoptotic rates among different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;##P<0.05vsAxn group;△P<0.05vsLBer group;▲P<0.05vsMBer group.

圖2 各組細胞凋亡率的比較

3 小檗堿對損傷胰島β細胞PTEN/PI3K/Akt信號通路的影響

Western blotting法發現，與Con組相比，Axn組PTEN表達水平顯著升高，PI3K表達水平及Akt磷酸化水平則顯著降低；而與Axn組相比，小檗堿處理的LBer、MBer及HBer組，PTEN表達水平隨著濃度升高而下降，同時PI3K表達水平及Akt磷酸化水平則顯著升高,見圖3。

4 小檗堿對損傷胰島β細胞cleaved caspase-3水平的影響

與Con組相比，Axn組cleaved caspase-3水平顯著升高；而與Axn組相比，LBer、Mber以及HBer組cleaved caspase-3水平則明顯降低，且呈現顯著的濃度依賴性,見圖4。

Figure 3.Comparison of PTEN/PI3K/Akt pathway activation among different groups.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsAxn group;△P<0.05vsLBer group;▲P<0.05vsMBer group.

圖3 各組細胞PTEN/PI3K/Akt通路活化情況的比較

5 小檗堿對損傷胰島β細胞胰島素分泌水平的影響

在四氧嘧啶的作用下，Axn組的基礎胰島素釋放量及葡萄糖刺激胰島素釋放量均較Con組顯著降低，而接受小檗堿處理的LBer、MBer及HBer組的基礎胰島素釋放量及葡萄糖刺激胰島素釋放量均較Axn組顯著改善，且呈明顯的濃度依賴性,見表1。

6 小檗堿對損傷胰島β細胞HNF-1α/PDX-1信號通路的影響

如圖5所示，與Con組相比，Axn組的HNF-1α及PDX-1表達均顯著下調；而與Axn組相比，LBer、MBer以及HBer組的HNF-1α及PDX-1表達均顯著增加，且呈現明顯的濃度依賴性。

討 論

隨著社會與經濟的發展，現代社會營養過剩及運動減少等生活方式的轉變，發達國家及發展中國家人群糖尿病發病率均呈現逐年顯著升高的趨勢。糖尿病的并發癥，包括糖尿病心肌病、糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變以及糖尿病周圍神經病變等極大程度地降低患者生活質量甚至威脅患者的生命。作為一種多病因的代謝紊亂性疾病，雖然發病機制復雜，但胰島β細胞絕對數量減少及分泌胰島素功能障礙是導致糖尿病發病的根本原因。胰島細胞代謝旺盛，相比于機體內其它組織細胞，β細胞對外界不良刺激的易感性更強。四氧嘧啶能夠對β細胞產生特異性的細胞毒性，通過產生自由基等造成β細胞損傷[3]。本研究采用四氧嘧啶制作胰島β細胞損傷模型，發現β細胞凋亡增多，且其胰島素分泌功能下降，與既往研究相符。

Figure 4.Comparison of the cleaved caspase-3 levels among different groups.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsAxn group;△P<0.05vsLBer group;▲P<0.05vsMBer group.

圖4 各組激活型caspase-3水平的比較

表1 各組基礎及葡萄糖刺激胰島素釋放量的比較

Table 1.The basal insulin release and stimulated insulin release in different groups (Mean±SD.n=3)

GroupBasalinsulinrelease(mIU/L)Stimulatedinsulinrelease(mIU/L)Con2.25±0.314.86±0.17Axn0.89±0.10*1.14±0.09*LBer1.28±0.21#1.87±0.10#MBer1.79±0.20#△2.33±0.08#△HBer2.04±0.24#△▲3.27±0.11#△▲

*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsAxn group;△P<0.05vsLBer group;▲P<0.05vsMBer group.

研究發現，小檗堿在包括細菌/病毒感染、血脂紊亂、炎癥、惡性腫瘤、骨質疏松以及糖尿病等多種疾病中均具有顯著的治療作用。在我國傳統中醫中，糖尿病又被稱為消渴癥，而早在我國古代魏晉時期就已經有用中藥黃連治療消渴癥的記載[4]。近年來的研究表明，小檗堿在治療糖尿病時具有類似磺脲類藥物的降血糖藥理活性[5]，但其機制尚未研究清楚。PTEN是上世紀90年代在腫瘤細胞內首先發現的一種抑癌因子，隨后的研究表明其還在細胞生長、分化、凋亡、遷移及胚胎發育中扮演重要的角色。PI3K是PTEN下游的作用底物分子之一，PTEN以其PI3K酶活性抑制PI3K的作用，從而使PI3K下游的Akt分子磷酸化程度降低，上述3個分子構成PTEN/PI3K/Akt信號通路。PTEN表達增高后可抑制PI3K/Akt的活性而促進細胞凋亡，此時caspase瀑布級聯反應被激活[6]。本研究發現，在四氧嘧啶作用后，INS-1細胞內PTEN表達升高，而PI3K/Akt信號則被抑制，同時激活型caspase-3水平增高，INS-1細胞凋亡率升高。而在小檗堿干預后，隨著藥物濃度的提高，INS-1細胞內PTEN表達水平降低，PI3K/Akt信號被激活，細胞凋亡率顯著降低，表現為細胞內激活型caspase-3水平下降。上述結果表明小檗堿能夠通過影響PTEN/PI3K/Akt信號通路對四氧嘧啶誘導的INS-1胰島細胞凋亡起保護作用。

Figure 5.Comparison of HNF-1α/PDX-1 pathway activation among different groups.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsAxn group; △P<0.05vsLBer group;▲P<0.05vsMBer group.

圖5 各組HNF-1α/PDX-1信號通路活化情況的比較

如前所述，除了胰島β細胞凋亡，糖尿病時β細胞分泌胰島素功能也出現障礙。在INS-1胰島素分泌實驗中發現，四氧嘧啶導致的細胞損傷使INS-1基礎胰島素釋放量及葡萄糖刺激下胰島素釋放量均顯著降低。而使用小檗堿處理細胞后，隨著小檗堿藥物濃度的不斷升高，INS-1細胞基礎及葡萄糖刺激下的胰島素釋放量均顯著升高。本研究結果初步顯示這一作用機制與小檗堿對HNF-1α/PDX-1信號通路的激活作用有關。除了在脂肪酸代謝調節中的關鍵作用，HNF-1α基因表達的缺失被認為參與了胰島β細胞胰島素分泌障礙的發生，因而與糖尿病發病有關。因其直接參與啟動胰島素的轉錄與合成過程，PDX-1是經典的胰島β細胞胰島素分泌功能的分子標記物[7]。近期的數項研究均表明，PDX-1是HNF-1α的下游分子，后者能夠通過與PDX-1基因啟動區直接作用而促進PDX-1的分泌[8]。本研究發現，在四氧嘧啶損傷的INS-1細胞中，HNF-1α/PDX-1信號通路被顯著抑制，而在小檗堿作用后，INS-1細胞HNF-1α/PDX-1信號通路出現顯著的激活狀態，最終表現為胰島β細胞胰島素分泌功能的恢復。

綜上所述，小檗堿對四氧嘧啶損傷的INS-1胰島β細胞具有保護作用，表現為對其凋亡的抑制與胰島素分泌功能的恢復，分別與影響細胞內PTEN/PI3K/Akt及HNF-1α/PDX-1信號通路有關。

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Protective effects of berberine in pancreatic islet beta cells

WU Hui-ling

(DepartmentofEndocrinology,FirstHospitalofZiboCity,Zibo255200,China.E-mail:axemaxme@sina.com)

AIM: To explore the protective effects of berberine (Ber) on islet beta cells and related possible mechanisms. METHODS: The injury of INS-1 cells was induced by treatment with alloxan (Axn). Berverine was then given at serial concentrations. The cells were divided into control group (Con), injury group (Axn), low-dose berberine group (LBer), medium-dose berberine group (MBer) and high-dose berberine group (HBer). Flow cytometry was employed to detect the apoptosis. The activation of PTEN/PI3K/Akt and HNF-1α/PDX-1 pathways and the protein level of cleaved caspase-3 were evaluated by Western blotting. The insulin releases under normal or high-glucose stimulation were measured by ELISA. RESULTS: Compared with Con group, the apoptotic rate increased significantly in Axn group. Berberine treatment reduced the apoptotic rate in LBer group, MBer group and HBer group in a concentration-dependent manner. Compared with Con group, the protein levels of PTEN and cleaved caspase-3 increased, while PI3K and phosphorylation of Akt decreased significantly in Axn group. However, this effect was reversed by berberine in a concentration-dependent manner. Compared with Con group, the activation of HNF-1α/PDX-1 signaling pathway was inhibited in Axn group but recovered by berberine administration. The abilities of releasing insulin under normal or high-glucose stimulation were impaired in Axn group but recovered by berberine treatment in LBer group, MBer group and HBer group in a concentration-dependent manner.CONCLUSION: Berberine shows protective effects against alloxan-induced damage in beta cells by inhibiting apoptosis and recovering insulin secretion, thus attenuating the activation of PTEN/PI3K/Akt and HNF-1α/PDX-1 signaling pathways.

Berberine; β-cells; Apoptosis; Insulin

1000- 4718(2014)12- 2213- 06

2014- 07- 03

2014- 08- 03

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.017

△通訊作者 Tel： 0533-4252412; E-mail： axemaxme@sina.com