肥大細胞干細胞因子在人慢性根尖周病中的表達*

靳 華， 施慶顏， 梁經文， 黃世光△

(1武警廣東省總隊醫院口腔科，廣東 廣州 510507； 2暨南大學醫學院口腔醫學系，廣東 廣州 510632)

肥大細胞干細胞因子在人慢性根尖周病中的表達*

靳 華1▲， 施慶顏2▲， 梁經文2， 黃世光2△

(1武警廣東省總隊醫院口腔科，廣東 廣州 510507；2暨南大學醫學院口腔醫學系，廣東 廣州 510632)

目的： 觀察干細胞因子(stem cell factor，SCF)在慢性根尖周病患者肥大細胞(mast cells，MCs)中的表達情況，探討SCF陽性MCs在根尖周病發病機制及根尖周纖維組織的形成，尤其在根尖周囊腫纖維組織形成中的作用。方法: 選擇2011年7月～2013年6月期間在暨南大學荔灣口腔教學醫院臨床診斷為根尖囊腫或根尖肉芽腫并接受根尖刮治手術的病例30例，其中根尖肉芽腫15例，根尖囊腫15例。正常對照組20例，取自因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙。標本經10%甲醛固定48 h以上。組織標本經石蠟包埋、組織連續切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察其組織學改變；采用免疫組織化學法，觀察各組標本組織中MCs數目及MCs脫顆粒情況；采用免疫熒光雙染色法，在熒光顯微鏡下觀察各組標本組織中tryptase-SCF雙陽性MCs數目。結果: 免疫組織化學染色結果顯示，2組慢性根尖周病組織中MCs和脫顆粒MCs數量與正常對照組相比顯著增多(P<0.01)；根尖囊腫組的MCs和脫顆粒MCs的數量均明顯高于根尖肉芽腫組(P<0.05)。免疫熒光雙染色結果顯示，2組慢性根尖周病組織中的tryptase-SCF雙陽性MCs密度與正常對照組相比顯著增多(P<0.01)；根尖囊腫組tryptase-SCF雙陽性MCs密度明顯高于根尖肉芽腫組(P<0.05)。各組標本組織中免疫組織化學染色MCs密度與免疫熒光雙染色MCs密度無顯著差異(P>0.05)。結論: Tryptase-SCF雙陽性肥大細胞在慢性根尖周病的炎癥損害，尤其在根尖囊腫的纖維組織形成中發揮重要作用。Tryptase-SCF雙陽性肥大細胞與慢性根尖周病炎癥損害的發生、進展及其持續存在有關。

慢性根尖周病； 肥大細胞； 類胰蛋白酶; 干細胞因子

根尖周疾病是宿主防御感染根管內微生物的炎癥反應過程，導致根尖周組織的炎癥和骨質吸收破壞[1]。在人類，肥大細胞(mast cells，MCs)有2個亞型，根據類胰蛋白酶(tryptase)和類糜蛋白酶(chymase)的表達差異，分為結締組織型肥大細胞(connective tissue mast cell, CTMC)和黏膜型肥大細胞(mucosal mast cell, MMC)，其中CTMC含類胰蛋白酶、類糜蛋白酶、MC羧基肽酶(mast cell carboxypeptidase，MC-CP)和組織蛋白酶G(cathepsin G，CG)。CTMC既含有類胰蛋白酶又含有類糜蛋白酶，而MMC只含類胰蛋白酶，不含類糜蛋白酶[2]。研究顯示干細胞因子(stem cell factor，SCF)作用于MCs，誘導MCs的存活、增殖和分化[3]。SCF/c-Kit信號與炎癥反應、過敏性哮喘以及纖維化等疾病均有密切關系。我們前期研究已經表明肥大細胞的募集和脫顆粒[4]、肥大細胞Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)、T細胞免疫球蛋白黏蛋白1(T-cell immunoglobulin mucin 1，TIM-1)和TIM-3與牙周病及其炎癥程度密切相關[5-7]，提示肥大細胞在牙周病的發病及病理過程中起重要作用。盡管進行了大量的實驗及臨床研究，有關MCs的SCF參與根尖周病的致病機制尚未見報道。本文采用免疫組織化學染色法，觀察各組根尖周病組織標本中MCs形態及脫顆粒情況并計數；采用免疫熒光雙染色法觀察各組標本組織中tryptase-SCF雙陽性肥大細胞的表達，探討SCF陽性MCs在根尖周病發病機制、根尖周纖維組織的形成，尤其在根尖周囊腫纖維組織形成中的作用。

材 料 和 方 法

1 研究對象

1.1 病例選擇 選擇2011年7月～2013年6月期間在暨南大學荔灣口腔教學醫院臨床診斷為根尖囊腫或根尖肉芽腫并接受根尖刮治手術并經病理檢查確診的病例30例，其中根尖肉芽腫15例(24～62歲)，根尖囊腫15例(23～60歲)。正常對照組20例(年齡16～22歲)為正常牙周膜，來自2013年6月～9月期間因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙，所有這些前磨牙牙根發育完全并且沒有根尖周病。所有患者均沒有系統性疾病而且至少兩個月前停止使用抗生素。樣本收集之前取得患者的書面知情同意書。

1.2 分組及取材 正常對照組為因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙牙周膜，共20例；根尖肉芽腫組為X線顯示患牙根尖周有圓形或橢圓形的密度降低區，直徑<1 cm，邊界清楚，組織學檢查見明顯的炎癥細胞浸潤，并無鱗狀上皮襯里，共15例；根尖囊腫組為X線顯示患牙根尖周有圓形或橢圓形的密度降低區，直徑>1 cm，邊界清楚,有白色阻射線包繞，組織學檢查見根尖區組織存在部分或全部上皮覆蓋，囊腫表現為完整的囊腔，囊腔為一定厚度的復層鱗狀上皮覆蓋。上皮層可見明顯炎癥細胞浸潤，纖維組織層以膠原纖維為主，未見明顯的炎癥細胞浸潤，共15例。

2 實驗方法

2.1 組織標本采集、處理與觀察 根尖肉芽腫和根尖囊腫標本是在進行根尖刮治手術時取得的根尖周病變組織。正常對照組標本取自因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙，用無菌刀片將牙周膜從牙根上刮取。樣本立即固定于10%甲醛溶液中48 h以上，經脫水、透明、浸蠟、包埋，制備成5 μm厚度組織連續切片。由2名病理醫師盲法觀察各組標本的組織學改變。

2.2 MCs免疫組織化學染色與觀察 抗tryptase I抗(Abcam)，稀釋濃度為1∶200；兔二步法試劑盒(北京中杉金橋生物工程有限公司)。組織切片通過常規脫蠟、乙醇復水，檸檬酸鹽緩沖液微波修復、山羊血清封閉、I抗孵育過夜、II抗孵育DAB顯色后用中性樹膠封片。免疫組織化學染色陽性信號為棕黃色或黑褐色細小顆粒，定位于細胞核和/或細胞漿。2名病理醫師于光學顯微鏡下觀察組織切片中MCs形態及脫顆粒情況并計數。在高倍視野下(×400)對每張切片中全部MCs計數，并記錄每張切片的組織面積大小。計算各組MCs及脫顆粒MCs密度。MCs密度=每張切片中MCs總數/每張切片的組織面積(mm2)；脫顆粒MCs密度=每張切片中脫顆粒MCs總數/每張切片的組織面積(mm2)。

2.3 Tryptase-SCF雙陽性MCs免疫熒光雙染色 抗tryptase I抗，稀釋濃度為1∶200；抗SCF I抗(Santa Cruz)稀釋濃度為1∶100；山羊抗鼠IgG Alex Flour 555?及山羊抗兔IgG Alex Flour 488?(Cell Signaling)稀釋濃度為1∶200。組織切片通過常規脫蠟、乙醇復水，檸檬酸鹽緩沖液微波修復、山羊血清封閉，I抗孵育，避光條件下II抗孵育,熒光染色后采用抗熒光淬滅封片液封片，立即在熒光顯微鏡下觀察。2名病理醫師于免疫熒光顯微鏡下觀察到MCs均表達有SCF，從而對各組實驗標本中tryptase-SCF雙陽性MCs計數并計算各組tryptase-SCF雙陽性MCs密度。在高倍視野下(×400)對每張切片的tryptase-SCF雙陽性MCs計數，并記錄每張切片的組織面積大小。tryptase-SCF雙陽性MCs密度=每張切片中tryptase-SCF雙陽性MCs總數/每張切片的組織面積(mm2)。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統計軟件進行分析。不同組間MCs密度及tryptase-SCF雙陽性MCs密度的比較采用Kruskal-Wallis 檢驗；3組之間存在差別則進行3個獨立樣本Nemenyi法檢驗兩兩比較。不同組間免疫組織化學染色法和免疫熒光雙染色法MCs密度的比較采用Wilcoxon符號秩檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 組織學觀察

正常對照組未見明顯炎癥細胞浸潤(圖1A)；根尖肉芽腫組可見大量炎癥細胞浸潤，主要為單核細胞、淋巴細胞和漿細胞呈灶性浸潤，其中巨噬細胞樣細胞和中性粒細胞呈散在浸潤(圖1B)；根尖囊腫組的上皮層表現為細胞間水腫，上皮下見大量以中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤(圖1C)；纖維組織層以膠原纖維為主，未見明顯的炎癥細胞浸潤(圖1D)。

2 MCs免疫組織化學染色

正常對照組的健康牙周膜組織中可見正常寄居的MCs，數量極少(圖2A)。根尖肉芽腫組與正常對照組相比，MCs的數量有所增加，MCs呈圓形或卵圓形，細胞邊緣整齊光滑，胞質顆粒均勻，部分MCs呈輕度～中度脫顆粒(圖2B)。根尖囊腫組可見大量MCs定位于囊性上皮稍下方、結締組織和上皮內區域，染色較深，形態多樣，MCs呈明顯脫顆粒現象，部分MCs崩解，異染性顆粒散落在細胞外(圖2C)。

Figure 1.Histology of the specimens (HE staining,×400).A: healthy control; B: periapical granuloma; C: the epithelial layer of periapical cyst; D: the fibrous tissue area of periapical cyst.

圖1 各組標本的組織學觀察

Figure 2.Representative photomicrographs of MCs infiltration with tryptase immunohistochemiscal staining (×1000). A: healthy control; B: periapical granuloma; C: periapical cyst.

圖2 各組標本MCs的免疫組織化學染色觀察

各組標本組織中MCs及脫顆粒MCs密度比較見圖3。與正常對照組相比，2組慢性根尖周病組織中MCs密度及脫顆粒MCs密度顯著上升(P<0.01)，且根尖囊腫組的MCs密度及脫顆粒MCs密度明顯高于根尖肉芽腫組(P<0.05)。

3 Tryptase-SCF雙陽性MCs免疫熒光雙染色結果

各組標本組織中MCs均表達有SCF。正常對照組健康牙周膜組織中僅可見少量散在分布的tryptase-SCF雙陽性MCs；根尖肉芽腫組根尖周病變組織中tryptase-SCF雙陽性MCs數目明顯增多；根尖囊腫組根尖周病變組織囊性上皮稍下方、結締組織和上皮內tryptase-SCF雙陽性MCs數目顯著增多。見圖4。

Figure 3.Density of MCs and degranulated MCs.Mean±SD.**P<0.01vshealthy control;△P<0.05vsperiapical granuloma.圖3 各組標本組織中MCs及脫顆粒MCs的密度

Figure 4.Representative photomicrographs of MCs infiltration with tryptase-SCF immunofluorescence double staining (×1 000).

圖4 各組標本組織中的tryptase-SCF陽性MCs

3組標本組織中tryptase-SCF雙陽性MCs密度均不同(P<0.01)，其中根尖囊腫組tryptase-SCF雙陽性MCs密度最高。Nemenyi檢驗分析結果顯示：正常對照組與根尖肉芽腫組及根尖囊腫組tryptase-SCF雙陽性MCs密度之間存在顯著差異(P<0.01)；根尖囊腫組tryptase-SCF雙陽性MCs密度明顯高于根尖肉芽腫組(P<0.05),見圖5。

Figure 5.Density of tryptase-SCF positive MCs.Mean±SD.**P<0.01vshealthy control;△P<0.05vsperiapical granuloma.

圖5 各組標本組織中tryptase-SCF雙陽性MCs的密度

4 免疫組織化學染色與免疫熒光雙染色MCs密度的比較

免疫組織化學染色結果中MCs密度與免疫熒光雙染色結果中MCs密度之間無顯著差異(P>0.05)，見圖6。

Figure 6.The comparison of immunohistochemistry staining (IHC) and double immunofluorescence staining (IF).Mean±SD.

圖6 各組標本免疫組織化學染色與免疫熒光雙染色MCs的密度比較

討 論

根尖周疾病的發生、發展及轉歸與根尖周組織的免疫應答密切相關[8]，MCs和巨噬細胞是根尖周病炎癥浸潤的重要組成部分[9]，且表達多種細胞因子、趨化因子和受體，被認為是根尖周感染免疫應答的重要參與者。其中，一些細胞因子參與炎癥、組織修復及與根尖囊腫相關的骨吸收機制[10]。近年來研究發現MCs是重要的免疫調節性和效應細胞，在固有免疫和適應性免疫反應中均有重要作用[2]。研究顯示SCF作用于早期造血干細胞、原始造血祖細胞、MCs和黑色素細胞，誘導這些細胞存活、增殖和分化；SCF/c-Kit信號與炎癥反應、過敏性哮喘以及肝組織纖維化等疾病均有密切關系。

研究顯示根尖周病變區MCs的數量不多，主要集中于肉芽組織與纖維組織的移形過渡區和血管周圍[11]。Drazic等[12]觀察到根尖周病中脫顆粒的MCs與成纖維細胞相鄰，提示MCs可能在纖維組織形成中發揮重要作用。研究表明，根尖囊腫中MCs的細胞密度高于根尖周肉芽腫，MCs脫顆粒釋放的tryptase和前列腺素參與囊腫-骨接觸區的骨吸收，促進囊腫擴張[13]；在富含炎癥細胞的組織區域和囊腫上皮的下方均可檢測到MCs存在，同時位于牙槽骨邊界的MCs出現脫顆?，F象，表明MCs在早期骨破壞區處于高度激活狀態并能夠釋放tryptase，提示MCs及其tryptase可能在頜骨囊腫組織的增長中起到改建作用，同時破壞周圍骨組織，最終導致頜骨囊腫擴張[14]。本研究中我們采用免疫組織化學染色法對15例根尖肉芽腫、15例根尖囊腫和20例正常牙周膜進行檢測,結果顯示：2組慢性根尖周病組織中MCs和脫顆粒MCs數量較正常對照組明顯增多，且根尖囊腫組MCs和脫顆粒MCs數量均明顯高于根尖肉芽腫。我們的研究結果與多數研究者的結果一致，提示MCs參與根尖周病變過程。

SCF又稱肥大細胞生長因子(mast cell growth factor，MGF)、青灰因子(steel factor，SF)、原癌基因c-kit酪氨酸激酶受體配體(c-kitligand，KL)，是多能干細胞生長因子，SCF主要作用于早期造血干細胞、原始造血祖細胞、MCs和黑色素細胞，誘導這些細胞存活、增殖和分化[5]。體外實驗發現SCF可以由多種細胞(包括結構細胞和炎癥細胞)產生，其中結構細胞主要有成纖維細胞、上皮細胞、血管內皮細胞和平滑肌細胞，炎癥細胞主要有MCs和嗜酸性粒細胞[15]。

SCF及其受體c-Kit都能在MCs及嗜酸性粒細胞表面檢測到，在促炎細胞因子刺激下，SCF表達增加；另一方面，糖皮質激素可下調SCF在人肺成纖維細胞上的表達[16]，表明SCF可能影響炎癥細胞的功能。SCF是人MCs生長和分化的主要因子，可以抑制MCs凋亡維持其存活[17]；在炎癥病理狀態下，SCF在MCs的活化、黏附和趨化作用中發揮關鍵作用[18]。SCF不僅能夠直接誘導MCs脫顆粒，還能通過加強抗原刺激誘導MCs脫顆粒，釋放組胺等，促發MCs介導的炎癥反應[19]。在慢性創傷及牛皮癬患者的組織中均能檢測到SCF和c-Kit強烈表達，促使MCs持續性生長、活化；而在傷口愈合中，MCs有一過性活化，SCF的表達水平在早期急速增長后下降，與一過性活化MCs的表達水平相一致[20]。

盡管進行了大量的實驗及臨床研究，根尖周病變的免疫調節機制迄今尚未闡明，有關MCs的SCF參與根尖周病的致病機制尚未見報道。Tryptase陽性MCs與SCF相互作用，tryptase陽性MCs在SCF的作用下活化，表達并合成纖維化基因的生物活性因子，提示tryptase-SCF陽性MCs在根尖周病的發病機制，尤其在根尖周囊腫的纖維組織形成中發揮重要作用。因此，本課題我們采用免疫熒光雙染色法，觀察不同類型慢性根尖周病中MCs的分布、并分析MCs上SCF的表達情況。結果顯示：2組慢性根尖周病組織中tryptase-SCF雙陽性MCs密度較正常對照組顯著增多；根尖囊腫組tryptase-SCF雙陽性MCs密度明顯高于根尖肉芽腫組。本研究對于闡明SCF陽性MCs在根尖周病的發病機制、根尖周囊腫纖維組織形成中的作用具有理論意義和臨床指導價值?？刂芐CF陽性MCs或調節MCs的功能可能成為阻止根尖周病發展的一個治療,從而為根尖周病的治療提供新的靶點，為臨床治療根尖周病提供更有效的治療方向和途徑。

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Expression of stem cell factor in mast cells isolated from patients with chronic periapical diseases

JIN Hua1, SHI Qing-yan2, LIANG Jing-wen2, HUANG Shi-guang2

(1DepartmentofStomatology,ArmedPoliceCorpsHospitalofGuangdong,Guangzhou510507,China;2FacultyofDentistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:thshg@126.com)

AIM: To investigate the expression of stem cell factor (SCF) in tryptase -positive mast cells (MCs) in different types of human periapical diseases for determining the role of SCF and MCs in the pathogenesis of periapical diseases. METHODS: A total 50 cases of specimens were involved in this study, including healthy control (n=20), periapical cyst (n=15) and periapical granuloma (n=15). The tissue material was fixed in 10% formalin for at least 48 h, stained with hematoxylin and eosin for the observation of histopathology, stained with immunohistochemistry for identifying MCs and MCs degranulation, and stained with double immunofluorescence for identification of tryptase-SCF double positive MCs. RESULTS: Compared with healthy control, significantly higher densities of both total and degranulated MCs in human periapical lesions were observed. The densities of both total and degranulated MCs in the periapical cyst were significantly higher than that in the periapical granuloma. The density of tryptase-SCF double positive MCs in the periapical lesions was significantly higher than that in the healthy controls. The density oftryptase-SCF double positive MCs in the periapical cyst was significantly higher than that in periapical granuloma. No significant difference in the density of MCs between immunohistochemistry staining and double immunofluorescence staining was observed. CONCLUSION: The tryptase-SCF double positive MCs play an active role in the pathogenesis of the periapical inflammatory lesions, particularly in the formation of fibrous tissue in periapical cyst. The potential role of the tryptase-SCF double positive MCs relates with the initiation, development, and persistence of the periapical inflammatory process.

Chronic periapical disease; Mast cells; Tryptase; Stem cell factor

1000- 4718(2014)12- 2243- 06

2014- 06- 23

2014- 09- 15

廣東省醫學科研基金資助項目(No．A2013454)

R363； R781

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.022

△通訊作者 Tel: 020-85221165; E-mail: thshg@126.com

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