半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35引起線粒體膜Bcl-2、Bax、Bcl-xL及Bak異常的干預作用*

趙泓翔, 郭 可, 崔亞迪, 吳曉光, 商亞珍

(承德醫學院中藥研究所，河北省中藥研究與開發重點實驗室，河北省中醫藥抗癡呆重點研究室，河北 承德 067000)

半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35引起線粒體膜Bcl-2、Bax、Bcl-xL及Bak異常的干預作用*

趙泓翔, 郭 可, 崔亞迪, 吳曉光, 商亞珍△

(承德醫學院中藥研究所，河北省中藥研究與開發重點實驗室，河北省中醫藥抗癡呆重點研究室，河北 承德 067000)

目的： 探討半枝蓮黃酮(SBF)對大鼠腦室注射β-淀粉樣蛋白25-35(Aβ25-35)結合三氯化鋁(AlCl3)及重組人轉化生長因子β1(rhTGF-β1)(復合Aβ25-35)引起的皮層細胞線粒體膜凋亡相關蛋白異常的干預作用。方法: 雄性SD大鼠手術當天腦室注射10 ng rhTGF-β1，手術第2天開始腦室分別于上午注射Aβ25-35(4 μg/d，連續注射14 d)、下午注射1% AlCl3(3 μL/d ，連續注射5 d)建立神經損傷模型。術后第49天模型成功大鼠隨機分為模型對照組和3個劑量SBF組。藥物組大鼠分別連續灌胃 SBF (35、70和140 mg/kg)36 d，每日1次。大鼠末次給藥60 min后斷頭處死，蛋白印跡法測定各組大鼠皮層細胞線粒體膜Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak的蛋白表達水平。結果: 大鼠腦室注射復合Aβ25-35可使大鼠皮層細胞線粒體膜Bcl-2和Bcl-xL蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，使Bax和Bak蛋白表達水平明顯增加(P<0.01)。然而，35、70和140 mg/kg SBF灌胃36 d，可以不同程度地逆轉復合Aβ25-35所致上述改變。結論: 腦室注射Aβ25-35聯合AlCl3和rhTGF-β1可引起線粒體膜凋亡因子Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak異常改變，SBF能夠逆轉上述凋亡因子異常改變。

半枝蓮黃酮； β-淀粉樣蛋白25-35； 三氯化鋁； 重組人類轉化生長因子-β1； 線粒體凋亡通路

目前，神經退行性疾病已成為臨床上常見的疾病，神經細胞凋亡的加劇被認為是該病主要的現象之一[1]。細胞凋亡是機體正常細胞在受到生理或病理刺激后出現的自發性死亡，是一個高度有序的、主動的、由基因控制和多種酶參與的程序化死亡過程[2]。研究表明，異常的細胞凋亡與很多疾病如炎癥、腫瘤和神經退行性疾病的發生、發展密切相關[3]。根據細胞凋亡的啟動，細胞凋亡分為線粒體凋亡通路、內質網凋亡通路和死亡受體通路。線粒體凋亡通路是細胞凋亡中一條非常重要的通路，凋亡刺激通過線粒體膜上的一系列凋亡因子產生級聯反應，引起細胞凋亡，特別是Bcl-2家族中抑凋亡因子Bcl-2、Bcl-xL及促凋亡因子Bax、Bak異常表達在疾病的發生發展中發揮著重要作用[4-5]。

經過長期的研究發現，Aβ具有較強的神經毒性，腦室投放Aβ肽段可以誘發動物神經病理學改變，包括神經細胞凋亡[6]。如果結合鋁和重組人轉化生長因子β1(recombinant human transforming growth factor β1, rhTGF-β1)建立多因素神經損傷，更能較全面模擬臨床神經病變病人的病理生理特征[7-8]。半枝蓮黃酮(Scutellariabarbataflavonoids，SBF)是從半枝蓮(ScutellariabarbataD. Don)地上部分分離的黃酮類化合物，以野黃芩苷為主。已經發現，SBF具有解熱、抗菌、抗突變和抗氧化等多種功效，對去勢大鼠記憶障礙、神經內分泌及腦內自由基異常變化以及Aβ25-35對星形膠質細胞的損害具有明顯的治療作用[9-11]，但對Aβ25-35聯合AlCl3和rhTGF-β1(復合Aβ25-35)引起動物神經損害、特別是線粒體凋亡通路中線粒體膜上的凋亡因子的影響尚未見報道。本實驗利用大鼠腦室注射Aβ25-35聯合AlCl3和rhTGF-β1建立神經損害模型，探討SBF對復合Aβ模型大鼠皮層細胞線粒體膜凋亡因子Bcl-2、Bax、Bak和Bcl-xL異常變化的干預結果。

材 料 和 方 法

1 實驗動物與藥品

清潔級健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(合格證編號：90912)體重300～350 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供。飼養于承德醫學院實驗動物中心，手術前適應性飼養1周，自由進食，12 h光照明/暗交替。半枝蓮黃酮由本實驗室制備；兔抗大鼠Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak多克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供；Aβ25-35由上海強耀生物科技有限公司提供；線粒體/胞漿制備試劑盒 C1260購于北京普利來基因技術有限公司，其它試劑購于試劑商店。

2 方法

2.1 動物模型的建立 300～350 g健康雄性SD大鼠，實驗室適應性飼養1周，術前禁食12小時。腹腔注射10%水合氯醛 (300 mg/kg) 麻醉,常規消毒，固定于大鼠腦立體定位儀，顱頂正中矢狀切開，暴露硬腦膜，標記前鹵點位置。參照包新民編著《大鼠腦立體定位圖譜》，以前鹵點為坐標原點，于前鹵點后2.0 mm、矢狀縫右側旁開1.4 mm、深4.6 mm確認丘腦背側核位置。于前鹵點后1.2 mm、矢狀縫左側旁開2.0 mm、深4.0 mm確認側腦室位置，三棱錐鉆一直徑為0.2 mm孔，埋置導管,用硫酸鋅水門汀固定導管。模型對照組側腦室給藥Aβ25-3514 d，AlCl35 d，給藥速度為1 μL/min，假手術對照組給予等體積生理鹽水，首次注射時在丘腦前背側核注入rhTGF-β110 ng。縫合傷口，常規飼養。術后3 d內肌肉注射青霉素每日1次，1次1×105U。歸籠飼養，在手術第45天利用Morris水迷宮進行4 d的大鼠記憶障礙模型篩選，以第4天水迷宮篩選成績計算，模型對照組大鼠篩選率大于0.2，即為模型成功大鼠，本實驗模型成功率 94.7%。有關大鼠學習、記憶研究將另文報道。

2.2 實驗動物分組、給藥及樣品制備 在手術第 49 天，模型成功大鼠隨機分4組，模型對照組和3劑量藥物組，藥物組大鼠連續用SBF灌胃(每日劑量為35、70和140 mg/kg)36 d，模型對照組和假手術對照組大鼠給予等體積的生理鹽水。大鼠手術第85天，即給藥第36天，所有大鼠在給藥60 min后乙醚麻醉，斷頭處死，冰上分離大腦皮層放在1.5 mL無RNA酶的EP管中，凍存于-80 ℃超低溫冰柜中備用。

2.3 Western blotting檢測大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak的測定 200 mg皮層組織與1.5 mL Mito Solution反復研磨，800 ×g4℃ 離心5 min，取上清12 000×g4 ℃ 再離心10 min，此時上清液為細胞的胞液成分，在管底的沉淀即為線粒體。

將得到的線粒體加入0.2 mL Mito Solution進行洗滌，12 000×g4 ℃ 離心10 min，棄上清，沉淀加RIPA裂解液，得到線粒體液，利用BCA法測定線粒體蛋白濃度。樣品與上樣buffer混勻，95 ℃ 加熱使蛋白變性，根據測定的蛋白濃度每孔上樣50 μg，10% SDS-PAGE分離蛋白約1.5 h，轉移至PVDF膜封閉2 h。在Ⅰ抗Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak稀釋液中孵育PVDF膜2 h，TBST洗后置于Ⅱ抗稀釋液孵育1 h，TBST洗后蛋白印跡顯影，膠片掃描后，采用Quantity One 軟件對顯影條帶進行分析，計算Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak條帶與β-actin條帶的體積比和光密度比值，作為它們的蛋白相對表達量。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，使用統計學軟件SPSS 17.0進行統計學分析，組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35所致大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-2蛋白表達的影響

圖1顯示，與假手術組相比，模型組大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.01)。然而劑量為35、70和140 mg/kg的SBF不同程度地增加了大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-2的蛋白表達，與模型組相比，SBF 70和140 mg/kg組的Bcl-2蛋白表達量顯著增加(P<0.05或P<0.01)。

Figure 1.The effect of SBF on Bcl-2 protein relative expression level in the cerebral cortex cell mitochondria of the rats treated with composite Aβ25-35.Mean±SD.n=3.##P<0.01vssham;*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

圖1 SBF對注射復合Aβ25-35大鼠的皮層細胞線粒體膜上Bcl-2蛋白表達的影響

2 半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35所致大鼠皮層細胞線粒體膜上Bax蛋白表達的影響

圖2顯示，與假手術組比較，模型組大鼠皮層細胞線粒體膜上Bax的蛋白表達明顯增加(P<0.01)。然而，劑量為 35、70和140 mg/kg的SBF能顯著降低復合Aβ25-35所致的大鼠皮層細胞線粒體膜上Bax蛋白表達量的升高(P<0.05或P<0.01)。

Figure 2.The effect of SBF on Bax protein relative expression level in the cerebral cortex cell mitochondria of the rats treated with composite Aβ25-35. Mean±SD.n=3.##P<0.01vssham;*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

圖2 SBF對注射復合Aβ25-35大鼠的皮層細胞線粒體膜上Bax蛋白表達的影響

3 半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35所致大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-xL蛋白表達異常的影響

圖3顯示，與假手術組相比，(P<0.01)。然而，劑量為 35、70和140 mg/kg的SBF能顯著增加注射復合Aβ25-35大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-xL蛋白的表達量(P<0.05或P<0.01)。

4 半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35所致大鼠皮層細胞線粒體膜上Bak蛋白表達異常的影響

與假手術組相比，模型組大鼠皮層中Bak蛋白的表達明顯增加(P<0.01)。然而，劑量為35、70和140 mg/kg的SBF顯著降低注射復合Aβ25-35大鼠皮層細胞線粒體膜上Bak蛋白的表達量(P<0.01)，見圖4。

討 論

流行病調查顯示，隨著全球人類的老齡化，神經退行性病人日益增多，而神經細胞凋亡性病理改變是這些病人神經病變主要的特征性改變之一[12]。細胞凋亡又稱為細胞程序化死亡，是一個高度主動有序、多個基因和蛋白因子參與調控的正常的生理活動過程[13]。然而，當細胞遭受病理性刺激后，細胞凋

Figure 3.The effect of SBF on Bcl-xL protein relative expression level in the cerebral cortex cell mitochondria of the rats treated with composite Aβ25-35. Mean±SD.n=3.##P<0.01vssham;*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

圖3 SBF對注射復合Aβ25-35大鼠的皮層細胞線粒體膜上Bcl-xL蛋白表達的影響

Figure 4.The effect of SBF on Bak protein relative expression level in the cerebral cortex cell mitochondria of the rats treated with composite Aβ25-35. Mean±SD.n=3.##P<0.01vssham;**P<0.01vsmodel.

圖4 SBF對注射復合Aβ25-35大鼠的皮層細胞線粒體膜上Bak蛋白表達的影響

亡就會異常加劇，而異常的細胞凋亡與一系列疾病包括神經退行性疾病的發生、發展密切相關[14-15]。

在神經系統中，神經細胞凋亡是神經元丟失的重要原因，Aβ蛋白可以引起神經細胞內鈣離子失衡，而鈣離子超載與線粒體途徑凋亡有密切關系。線粒體凋亡路徑為Aβ誘導神經細胞凋亡的主要途徑，其中Aβ可引起線粒體的損害和相關凋亡蛋白的改變。眾所周知，線粒體是機體能量的動力工廠，線粒體的狀態是否正常直接調控著細胞的死亡模式，而線粒體通路中相關凋亡因子在疾病發生、發展以及藥物作用研究中發揮重要作用。線粒體膜上存在著多種與細胞凋亡相關的重要蛋白因子，Bcl-2家族成員Bcl-2、Bax、Bak、Bcl-xL等嚴格控制著線粒體外膜的通透性，調控細胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)的釋放和細胞凋亡[16]。Bcl-2和Bax是線粒體外膜上一對相互拮抗的細胞凋亡因子，Bcl-2是抗細胞凋亡因子，它能夠降低線粒體膜的通透性，抑制Cyt-C的釋放；Bax是促細胞凋亡因子，正常情況下Bax是以單體形式存在于線粒體膜上，當細胞接受凋亡信號時，Bax則形成二聚體促進Cyt-C的釋放，同時Bcl-2能夠抑制Bax的構象改變，阻止Bax二聚體的形成而減少Cyt-C 的釋放。Bak與Bcl-xL是線粒體外膜上又一對互相拮抗的凋亡因子，Bak促進細胞凋亡，Bcl-xL抑制細胞凋亡，Bak和Bcl-xL也是通過影響線粒體外膜的通透性來調節Cyt-C釋放，當Bak占優勢時Cyt-C自線粒體釋放。當細胞色素C一旦從線粒體釋放到胞液中，Cyt-C則與凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease-activated factor-1，Apaf-1)和caspase-9相互作用，從而激活caspase-3,導致細胞凋亡[17]。

在細胞線粒體凋亡通路中，DNA被降解為片段也是細胞凋亡常見的結果[18]。有人認為在神經退行性病人中最初可能是DNA損傷，然后出現Bcl-2和Bax調控的改變，直至細胞死亡丟失。更有報道在神經元和小膠質細胞中均發現Bax的表達，表明Bax可能是神經元死亡的早期事件[19]。體外研究發現，Aβ能上調Bak的表達，下調Bcl-xL的表達；體內動物實驗發現，Aβ使腦內Bak表達增強，使Bcl-xL的表達減少或者沒有明顯影響[20]，故推測Aβ可能通過促進Bak的表達來改變Bak/Bcl-xL之間的平衡，而誘導細胞凋亡。在內源性凋亡途徑中，Bcl-2和Bcl-xL可直接在線粒體外膜上形成一種陽離子通道和穩定的膜電位，該通道抑制Cyt-C的釋放。Bax和Bak在線粒體外膜上通過空間構象的改變形成的通道是一種陰離子通道，而該通道促進Cyt-C的釋放，這樣抗凋亡因子和促凋亡因子在線粒體膜上形成的通道對Cyt-C的釋放起相反的調控作用[21]。進一步實質性的研究發現，線粒體Cyt-C的釋放是通過膜滲透性轉變孔道復合物(permeability transition pore complex, PTPC)來完成的，Bcl-2家族的凋亡因子直接調節著PTPC，而PTPC是一種大分子多蛋白復合體，其大部分組件是電壓依從性陰離子通道，線粒體膜上促凋亡因子Bax和Bak能夠直接打開脂質體電壓依從性陰離子通道，消除線粒體膜電位，促進Cyt-C的釋放；線粒體膜上抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL能夠穩定膜電位，阻止Cyt-C的釋放[22]。釋放的Cyt-C進一步激活其下游凋亡因子，直至激活最終效應因子caspase-3而導致細胞凋亡。

細胞凋亡特別是線粒體凋亡通路介導的細胞凋亡直接參與了神經退行性疾病的發生發展，因此，任何能夠抑制細胞凋亡的手段，都有利于這些疾病的治療。本研究利用腦室注射Aβ25-35聯合AlCl3和rhTGF-β1建立多因素神經損傷模型，探討大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak的變化以及SBF干預的作用。結果發現，與假手術大鼠相比，腦室注射復合Aβ25-35大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表達明顯降低、Bax和Bak的蛋白表達明顯增加。Bcl-2/Bax和Bcl-xL/Bak這兩對作用相反的細胞凋亡因子共同促進Cyt-C的釋放，激活其下游的一系列凋亡因子，引發細胞凋亡。然而，SBF灌胃模型大鼠36 d明顯翻轉由復合Aβ25-35所致皮層細胞線粒體膜上Bcl-2、Bcl-xL、Bax和Bak蛋白表達的異常，穩定線粒體凋亡通路相關凋亡因子，抑制Cyt-C的釋放，從而抑制細胞凋亡。

本實驗室以往的研究已經證明，SBF能顯著改善去卵巢大鼠學習記憶障礙及免疫、內分泌異常，調節腦內自由基系統，SBF這些作用源于它是黃酮類化合物，具有多羥基結構和較強的還原性，可通過自身氧化阻止膜脂質結構過氧化，保證了包括線粒體在內膜結構的完整性和通透性。結合以往的研究，本實驗提示，SBF改善復合Aβ25-35所致皮層細胞線粒體膜Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak蛋白異常表達與其對線粒體膜結構的保護密切相關，而線粒體結構與功能以及線粒體凋亡通路的正常調節都參與了SBF 抗細胞凋亡的過程。本研究為SBF可用于神經退行性疾病的治療提供了實驗依據。

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Effect ofScutellariabarbataflavonoids on abnormal changes of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bak protein expression in mitochondrial membrane induced by composite Aβ25-35

ZHAO Hong-xiang, GUO Ke, CUI Ya-di, WU Xiao-guang, SHANG Ya-zhen

(InstituteofTraditionalChineseMedicine,ChengdeMedicalCollege,HebeiProvinceKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineResearchandDevelopment,HebeiProvincialResearchOfficeofTraditionalChineseMedicineAgainstDementia,Chengde067000,China.E-mail:shangyz1018@sina.com)

AIM: To study the abnormalities of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bax in the cell mitochondrial membrane of cerebral cortex in the rats injected with β-amyloid beta protein 25-35 (Aβ25-35) in combination with aluminum trichloride (AlCl3) and recombinant human transforming growth factor β1(rhTGF-β1) (composite Aβ25-35) into lateral cerebral ventricle, and to explore the intervention ofScutellariaBarbataflavonoids (SBF). METHODS: The male SD rats were used to establish the neuronal damaged model by receiving injection of rhTGF-β1 1 μL (10 ng) on day 1 of operation, and then from day 2 of operation, intracerebroventricular injection of Aβ25-35(4 μg/d， consecutive 14 d) in the morning and 1% AlCl3in the afternoon (3 μL/d， consecutive 5 d). On the day 49 of operation, the successful model rats were randomly divided into model control and 3 doses of SBF groupss. The rats in SBF groups were daily orally administered with SBF at doses of 35, 70 and 140 mg/kg for 36 d. All the rats were decapitated 60 min after the last administration. The protein expression of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bak in rat cerebral cortex cell mitochondrial membrane was detected by Western blotting. RESULTS: The composite Aβ25-35dramatically caused decreases in Bcl-2 and Bcl-xL (P<0.05), and increases in Bax and Bak (P<0.01) in rat cerebral cortex cell mitochondrial membrane. However, oral treatment with SBF for 36 d reversed the above disorders induced by composite Aβ25-35. CONCLUSION: The composite Aβ25-35induces the expression abnormalities of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bak in mitochondrial membrane and SBF reverses the above disturbances of apoptotic factors.

Scutellariabarbata flavonoids; β-Amyloid beta protein 25-35; Aluminum trichloride; Recombinant human transforming growth factor β1; Mitochondrial apoptosis pathway

1000- 4718(2014)12- 2262- 05

2014- 06- 23

2014- 09- 17

河北省自然科學基金資助項目(No. C2009001007； No. H2014406048)；河北省中醫藥管理局資助項目(No. 05027)；河北省高校重點學科建設項目

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.026

△通訊作者Tel: 0314-2290616; E-mail: shangyz1018@sina.com