新生兔氣管軟骨細胞的生物學特性*

陳 亮， 莊 建， 孫云霞， 梁穗新， 劉玉梅， 孫 新， 陳燕玲， 何少茹△

(1廣東省人民醫院兒科，廣東省醫學科學院， 2廣東省心血管病研究所小兒心臟外科，廣東 廣州 510080)

·實驗技術·

新生兔氣管軟骨細胞的生物學特性*

陳 亮1， 莊 建2， 孫云霞1， 梁穗新1， 劉玉梅1， 孫 新1， 陳燕玲1， 何少茹1△

(1廣東省人民醫院兒科，廣東省醫學科學院，2廣東省心血管病研究所小兒心臟外科，廣東 廣州 510080)

目的： 探討體外分離培養的新生兔氣管軟骨細胞的生物學特性。方法: 通過酶消化法體外分離培養新生兔氣管軟骨細胞；倒置顯微鏡觀察軟骨細胞形態及生長狀況；電鏡觀察軟骨細胞超微結構；運用real-time PCR、免疫細胞化學染色和甲苯胺藍染色檢測氣管軟骨細胞分泌的細胞外基質成分。結果: 體外分離、培養的兔氣管軟骨細胞呈短小三角形或不規則形貼壁生長。超微結構顯示細胞較多突起，孔隙較多，胞質豐富，細胞器發達，細胞內可見大量蛋白分泌物。軟骨細胞表達I、II型膠原、蛋白聚糖等，以II型膠原和蛋白聚糖表達為主。免疫細胞化學染色II型膠原和SOX9陽性，I型膠原弱陽性。甲苯胺藍染色陽性。結論: 適宜的酶消化單層培養法獲得的新生兔氣管軟骨細胞具有分泌軟骨細胞外基質成分的特性，可初步為體外構建組織工程氣管治療新生兔氣管狹窄的實驗研究提供種子細胞。

新生兔； 氣管軟骨細胞； 氣管狹窄； 種子細胞； 組織工程氣管

氣管狹窄被定義為由于不同病變所造成氣管腔的狹窄，在新生兒中發生率為1%～8%[1]。嚴重新生兒氣管狹窄的治療仍以外科手術為主[2-3]，但是新生兒氣管軟骨發育不完善，易受損傷、壓迫，術后并發癥及死亡率較高[4-5]。對于氣管狹窄患兒，保證氣管軟骨的穩定，對于維持氣道通暢具有重要的意義[6]。組織工程氣管治療氣管狹窄越來越受到關注[1,7-8]。由于氣管的環狀結構以軟骨為主，組織工程氣管種子細胞的研究主要集中在軟骨細胞領域。目前生物學修復軟骨缺陷的金標準是自體獲得的軟骨細胞移植[8]。盡管從鼻、關節和耳等部位獲得的軟骨細胞受到關注，但來源于不同解剖部位的軟骨細胞用于組織工程氣管移植仍存在爭議[9-10]。氣管軟骨組織中只含一種透明軟骨細胞，易于分離、成活，且具有良好的生物相容性及分泌蛋白聚糖(proteoglycans, PG)、II型膠原等細胞外基質成分的特性[11]。目前國內外對于氣管軟骨細胞生物學特性的研究主要是關于豬和成年兔的，尚未見對新生兔氣管軟骨細胞的詳細報道，因此，我們擬在體外分離、培養新生兔氣管軟骨細胞，并就獲得的新生兔氣管軟骨細胞進行形態學、細胞超微結構、細胞外基質成分(extracellular matrix, ECM)的mRNA及蛋白表達等分析，初步探討新生兔氣管軟骨細胞的基本生物學特性,嘗試在再生醫學基礎上為組織工程氣管體外構建的動物實驗研究初步提供一種可供選擇的種子細胞。

材 料 和 方 法

1 動物

新西蘭大白兔6只，出生后25～28 d，體重約0.8～1 kg，雄性，由南方醫科大學實驗動物中心提供。

2 主要試劑

3 主要方法

3.1 新生兔氣管軟骨細胞的分離及培養 根據參考文獻[12]分離培養細胞的方法, 無菌環境下取新西蘭新生大白兔氣管約2 cm(沿環狀軟骨下約0.5 cm)，放入含有青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液的培養皿中，去除氣管表面異物，放入無菌小燒杯中盡量剪碎，約1 mm×1 mm×1 mm，加入5 mL PBS緩沖液沖洗2次，加入0.25%胰酶-EDTA消化液消化30 min，PBS緩沖液沖洗2次，加入2 g/L II型膠原酶(量約氣管軟骨體積的3倍)，37 ℃水浴箱中孵育4 h，每間隔 0.5 h輕搖晃一次，至大部分氣管軟骨被消化、液體變渾濁時，加10%的胎牛血清1 mL終止消化，經200目尼龍篩過濾網過濾至另一15 mL離心管，保留濾液，1 500 r/min離心5 mim，去上清，加入5 mL完全培養基(DMEM/F12、10%胎牛血清、雙抗)混勻后移入75 cm2培養瓶，放入37 ℃、5% CO2培養箱中培養。每天倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化，初始第3天換1次液，隨后隔天換1次液，待細胞長至90%以上時傳代。

3.2 掃描及透視電鏡觀察第1代(passage 1，P1)軟骨細胞的超微結構 將培養的P1新生兔氣管軟骨細胞經0.25%胰酶-EDTA消化液消化收集，以PBS溶液清洗，離心成團后加2.5%的戊二醛固定送檢。

3.3 氣管軟骨細胞總RNA提取及real-time PCR 實驗組為P1和P6氣管軟骨細胞，對照組為骨髓間充質干細胞。取各組細胞進行誘導實驗 根據我們前期報道的方法[13]用TRIzol提取P1和P6新生兔氣管軟骨細胞和骨髓間充質干細胞的總RNA，使用逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix 獲得cDNA(反應條件：37 ℃ 15 min×3次，85 ℃ 5 s，4 ℃ 2 h)，熒光定量PCR過程使用熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM(反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s)。引物序列見表1，由Invitrogen公司設計，內參照為GAPDH。在PCR反應中，將正常的骨髓間充質干細胞作為對照組。Real-time PCR由熒光定量PCR儀自動采集目的基因與內參照基因的Ct值，各個基因的基因表達量根據公式2-ΔΔCt計算。

表1 Real-time PCR引物序列

F:forward; R:reverse.

3.4 免疫細胞化學染色檢測I、II型膠原及轉錄因子SOX9表達 將接種于培養皿中的P1和P6氣管軟骨細胞用PBS洗1 min×3次，用0.25%胰酶消化細胞；將細胞按1×109/L加入到放有無菌蓋玻片的6孔板中，待細胞長滿，用PBS洗5 min×3次，加入4%多聚甲醛固定20 min；用PBS洗5min×3次，加入0.5% 的Triton X-100作用20 min；PBS洗3次，3%雙氧水作用20 min，PBS洗3次；10%正常山羊血清封閉液封閉30 min，加入Ⅰ抗(1∶100)，4 ℃過夜，滴加Ⅱ抗37 ℃作用30 min，DAB顯色，加入蘇木素染色10 min，流水沖洗終止染色；將蓋玻片取出，中性樹膠封片，共聚焦顯微鏡下觀察。

3.5 甲苯胺藍染色檢測蛋白聚糖 將長滿85%以上形成集落的P1和P6氣管軟骨細胞的培養皿用PBS沖洗2次，勿將細胞沖洗掉，1%甲苯胺藍染液加入培養孔中，放入5% CO2培養箱中孵育2～3 h，去除甲苯胺藍染液，用PBS洗3次，倒置顯微鏡觀察。

“先吃一點吧”，黑背心從床下拉出一個包，“等完事了，你想怎么瀟灑就怎么瀟灑去！”他給我扔來兩包鍋巴，又甩來一瓶純凈水。

4 統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 新生兔氣管軟骨細胞的分離、培養

原代軟骨細胞培養24 h后，部分軟骨細胞成短小的多角形或不規則形貼壁生長,胞核清晰，細胞外基質折光性強，第6天細胞聚集形成明顯集落，增殖速度加快，約7～10 d細胞融合達90%以上；傳代的細胞貼壁迅速，約4～5 h部分貼壁，24 h已大部分貼壁,部分呈集落生長，4～5 d已融合達90%以上,呈魚群樣分布;傳代的軟骨細胞傳至P6，培養3～4 d仍呈多角形或不規則形貼壁且呈集落生長，胞核清晰，見圖1。

Figure 1.Culture of chondrocytes (×200). A: P0 chondrocytes, cultured for 24 h; B: P0 chondrocytes, cultured for 6 d; C: P1 chondrocytes, cultured for 24 h; D: P1 chondrocytes, cultured for 4～5 d; E: P6 chondrocytes, cultured for 3～4 d.

圖1 新生兔氣管軟骨細胞的分離、培養結果

2 電鏡觀察P1軟骨細胞的超微結構

掃描電鏡示，新生兔氣管軟骨細胞較多突起，有偽足，孔隙較多，胞質豐富，細胞表面見顆粒狀物質，見圖2。透射電鏡示:胞質豐富，粗面內質網、線粒體等細胞器發達，胞內可見空泡形成，有單個或成對的細胞核，細胞內可見大量蛋白分泌物，見圖3。

Figure 2.P1 chondrocytes observed by scanning electron micro-scopy (A: ×2 000; B: ×4 000).

圖2 第一代軟骨細胞掃描電鏡觀察結果

Figure 3.P1 chondrocytes observed by transmission electron microscopy(A: ×6 000; B: ×10 000).

圖3 第一代軟骨細胞透射電鏡觀察結果

3 Real-time PCR檢測氣管軟骨細胞I、II型膠原及蛋白聚糖mRNA的表達

P1和P6氣管軟骨細胞均表達I、II型膠原和蛋白聚糖,且以II型膠原和蛋白聚糖的表達為主；與對照組骨髓間充質干細胞比較,上述指標達水平明顯增高(P<0.05)，見表2、3。

表2 Real-time PCR檢測P1軟骨細胞COL2A、COL1A及PG mRNA的表達

Table 2.The mRNA expression of COL2A, COL1A and PG in the P1 chondrocytes determined by real-time PCR (Mean±SD.n=3)

CellsCOL2ACOL1APGBMMSCs1.0001.0001.000Chondrocytes23.664±1.389**5.416±1.756*7.521±0.303**

TableP<0.05,**P<0.01vsBMMSCs.

表3 Real-time PCR檢測P6軟骨細胞 COL2A、COL1A及PG mRNA的表達

Table 3.The mRNA expression of COL2A, COL1A and PG in the P6 chondrocytes determined by real-time PCR (Mean±SD.n=3)

CellsCOL2ACOL1APGBMMSCs1.0001.0001.000Chondrocytes16.999±1.894**5.209±0.653*7.289±0.433**

TableP<0.05,**P<0.01vsBMMSCs.

4 細胞免疫化學染色

P1氣管軟骨細胞II型膠原、I型膠原和SOX9免疫細胞化學染色后, 細胞胞漿染成紅色，核質分界清晰，且與II型膠原染色相比，I型膠原染色僅部分細胞染成紅色，部分細胞淺染，見圖4；P6氣管軟骨細胞II型膠原和蛋白聚糖免疫細胞化學染色后胞核呈藍色，胞漿呈紅色，且兩者分界清晰，見圖5。

5 甲苯胺藍染色檢測氣管軟骨細胞分泌的蛋白聚糖

經甲苯胺藍染色，P1和P6氣管軟骨細胞細胞核染成深藍色，細胞質及周圍組織染成藍紫色，胞核清晰，見圖6、7。

Figure 4.Immunohistochemical staining of the P1 chondrocytes (×200). A: negative control; B: COL1A; C: COL2A; D: SOX9.

圖4 第1代軟骨細胞免疫細胞化學染色結果

Figure 5.Immunohistochemical staining of the P6 chondrocytes (×400). A: negative control; B: COL2A; C: PG.

圖5 第6代軟骨細胞免疫細胞化學染色結果

Figure 6.P1 chondrocytes with toluidine blue staining (×100). A: unstained chondrocytes; B: stained chondrocytes.

圖6 第1代軟骨細胞甲苯胺藍染色結果

Figure 7.P6 chondrocytes with toluidine blue staining (×200). A: unstained chondrocytes; B: stained chondrocytes.

圖7 第6代軟骨細胞甲苯胺藍染色結果

討 論

再生醫學中，種子細胞是構建組織工程氣管的三個要素之一[1, 14]。作為組織工程氣管種子細胞的軟骨細胞主要來源有2個：(1)氣管、鼻間隔、肋軟骨、關節或耳等軟骨組織[9-11];(2)干細胞誘導分化。目前來源于不同解剖部位的細胞用于組織工程氣管細胞移植仍存在爭議。Kojima等[10]認為耳軟骨用于重建氣管組織時不能提供理想的機械性能，鼻軟骨細胞可用于組織工程氣管細胞移植。但是Henderson等[9]通過研究發現關節或鼻的軟骨細胞形成的軟骨材料缺乏完整的機械性能及硬度，耳軟骨卻具有一定的機械性能，認為在同等環境下，僅耳軟骨細胞在體內喉氣管重建中可產生合適的組織工程軟骨。經生長因子等不同因素刺激間充質干細胞誘導分化成軟骨細胞應用較廣泛，但是誘導分化成的軟骨細胞產生的軟骨質量明顯低于正常軟骨細胞產生的軟骨質量[15-17]。氣管是理想的軟骨細胞獲取部位。氣管軟骨組織中只含一種透明軟骨細胞，易于分離，且細胞氧耗低，易成活，具有良好的物理性質及生物相容性，體外有少量的氣管軟骨就可以培養出足夠的軟骨細胞，并在體內環境下形成氣管軟骨結構，能作為一種細胞來源去構建組織工程氣管以替換狹窄的氣管[11]。但是成年兔氣管軟骨細胞在體外隨著傳代次數的增多，細胞易失去原有的形態和生物學特征，出現去分化現象[18-20]。對于新生兔氣管軟骨細胞的生物學特性，目前研究仍未見詳細的報道。因此，作為新生兔組織工程氣管體外構建可選擇的種子細胞之一，需要進一步在體外分離培養新生兔氣管軟骨細胞的情況下，探討其生物學特性。

從軟骨組織中分離培養出軟骨細胞最常用的是酶消化貼壁篩選(單層培養)法[9,11-12,21]，其次是組織塊法。酶消化貼壁篩選法，是利用II型膠原酶和胰蛋白酶-EDTA消化液消化軟骨組織，獲得軟骨細胞，進行單層培養，并通過反復換液去除懸浮細胞而獲得純度較高的軟骨細胞,在臨床及試驗中廣泛應用。組織塊法是直接取軟骨組織進行培養，操作相對簡單，但培養時間較長，所獲得的軟骨細胞純度不夠。因此，本實驗采用酶消化貼壁篩選方法成功分離培養新生兔氣管軟骨細胞，并通過細胞形態學、超微結構和細胞分泌的細胞外基質成分等方面初步明確新生兔氣管軟骨細胞的生物學特性。

本實驗對分離培養的新生兔氣管軟骨細胞在倒置顯微鏡下觀察發現：所分離培養的新生兔氣管軟骨細胞為短小三角形或不規則形，生長至一定程度后呈鋪路石子樣聚集，傳代后細胞生長旺盛，短時間內可形成魚群樣聚集，細胞融合達95%以上，傳代至第6代時仍保持良好的生長狀態。大量文獻報道體外培養軟骨細胞易受到生長因子[22]、年齡[23]、力學[24]、氧氣[25]等多種因素通過物理環境和化學因子之間的相互刺激作用影響。從本實驗新生兔氣管軟骨細胞的生長變化觀察發現，在37 ℃、5% CO2環境中培養的早期，軟骨細胞生長緩慢，隨后生長顯著加快，傳代后生長旺盛，考慮對于新生兔氣管軟骨細胞，初期生長緩慢可能與接種的細胞密度低、從活體環境進入體外培養時因其生存環境和生長所需營養物質發生改變而需要一段時間適應新的環境以及細胞內部自分泌、細胞與細胞之間相互作用不充分等有關；隨著時間的延長，細胞逐漸適應環境，其數目增多，細胞內部及細胞與細胞之間相互作用增強,細胞生長速度明顯加快，這種變化符合正常細胞的生長特性。

軟骨細胞的形成是通過軟骨細胞外基質標記性基因的表達及蛋白的合成作為其特征[26]。細胞外基質是由一個復雜的網狀結構分子組成，包括彈性蛋白、膠原蛋白和蛋白聚糖等多種成分，其通過眾多糖蛋白及生長因子、細胞因子及腺體等調節細胞粘附、遷移和發揮功能[27]。細胞外基質可存在于細胞周圍、細胞內及細胞間，在固體基質內,50%～75%是膠原(包括I、II型膠原，但以II型膠原為主)、15%～30%是蛋白聚糖[28-29]。軟骨細胞的增殖、分化和自身穩態同時受到細胞外基質、可溶性介質及組成這些細胞的基因相互作用調控影響[30]。軟骨細胞形成與轉錄因子SOX9、 COMP、蛋白聚糖和II型膠原(COL2A)等基因的表達上調有關[31]。評估軟骨細胞表型常用的2個分子標志物是COL2A基因(編碼軟骨特異性的Ⅱ型膠原)與蛋白聚糖基因；且所有的軟骨及骨祖細胞都來源于SOX9表達的細胞,軟骨主要調控因子SOX9上調II型膠原的表達，可促進軟骨細胞的形成，并抑制軟骨細胞過度增生[32-33]；在上呼吸道軟骨發育過程中，SOX9募集細胞向軟骨細胞系譜生長并表達軟骨細胞特異性基因如COL2A，對調節細胞向軟骨細胞系譜的表達及正常上呼吸道軟骨的發育具有重要作用[6， 18]。本實驗發現P1和P6新生兔氣管軟骨細胞分泌的I型膠原、II型膠原、SOX9和蛋白聚糖等細胞外基質成分在mRNA和蛋白水平均有表達，且以II型膠原和蛋白聚糖表達為主，這與文獻關于氣管軟骨細胞主要分泌II型膠原和蛋白聚糖等細胞外基質成分的報道相一致[19-20, 29]。本實驗同時對軟骨細胞超微結構觀察也顯示新生兔氣管軟骨細胞在培養中會出現偽足，孔隙較多，胞質豐富，細胞表面見顆粒狀物質; 且細胞器發達,有單個或成對的細胞核,胞質中可見空泡；細胞內可見大量蛋白分泌物，與文獻報道相符[34]。以上結果說明新生兔氣管軟骨細胞傳代至第6代時仍具有分泌細胞外基質成分的生物學特性。

綜上所述，本研究通過酶消化單層培養法成功進行新生兔氣管軟骨細胞體外分離、培養，并對新生兔氣管軟骨細胞從形態學、超微結構、mRNA表達以及蛋白水平等進行了較全面的生物學特性的探討，初步認為新生兔氣管軟骨細胞具有分泌細胞外基質成分的生物學特性，可為組織工程氣管體外構建提供一種供選擇的種子細胞。

致謝：感謝“十二五”國家科技支撐計劃及廣東省心血管病研究所研究生經費資助，感謝廣東省人民醫院醫學研究中心實驗室及工作人員提供支持和無私的幫助服務。

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Biological characteristics of newborn rabbit tracheal chondrocytes

CHEN Liang1, ZHUANG Jian2, SUN Yun-xia1, LIANG Sui-xin1, LIU Yu-mei1, SUN Xin1, CHEN Yan-ling1, HE Shao-ru1

(1DepartmentofNeonatology,GuangdongGeneralHospital/GuangdongAcademyofMedicalSciences,2DepartmentofPediatricCardiacSurgery，GuangdongCardiovascularInstitute,Guangzhou510080,China.E-mail:hsr1605@126.com)

AIM: To investigate the biological characteristics of newborn rabbit tracheal chondrocytesinvitro. METHODS: Newborn rabbit tracheal chondrocytes were obtained by the method of enzyme digestion, and then cultured in monolayerinvitro. Morphological and growth observations were performed under inverted phase contrast microscope. The ultrastructures of the cells were observed under scanning electron microscope and transmission electron microscope. The biological characteristics of secreted extracellular matrix components were detected by real-time PCR, immunocytochemistry staining and toluidine blue staining. RESULTS: Newborn rabbit tracheal chondrocytes isolated and culturedinvitroshowed short triangular or irregular shapes, and adherent growth very well. The ultrastructures of the cells showed pore and abundant cytoplasm and organelles, with a lot of protein secretions in the cells. The chondrocytes expressed the mRNA of collagen I, collagen II and proteoglycans, mainly collagen II and proteoglycans. Immunocytochemistry staining showed collagen II and SOX9 positive, and collagen I weakly positive. Toluidine blue staining was also positive. CONCLUSION: Enzyme digestion and monolayer culture are suitable method to obtain newborn rabbit tracheal chondrocytes. These cells， secreting extracellular matrix components, are able to be selected as seed cells for tissue engineering of tracheainvitro, and used to study the therapeutic method for neonatal rabbit tracheal stenosis.

Newborn rabbits; Tracheal chondrocytes; Tracheal stenosis; Seed cells; Tissue-engineered trachea

1000- 4718(2014)12- 2294- 06

2014- 07- 02

2014- 09- 13

“十二五”國家科技支撐計劃(No.2011BAI11B22)

R329.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.033

△通訊作者 Tel: 020-83827812; E-mail: hsr1605@126.com