依達拉奉對實驗性小鼠自身免疫性腦脊髓炎的抑制作用

鄭慧敏，劉世軍，孫克明，劉憲勇, 郭俊青

依達拉奉對實驗性小鼠自身免疫性腦脊髓炎的抑制作用

鄭慧敏1，劉世軍1，孫克明1，劉憲勇1, 郭俊青2

目的研究依達拉奉對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)小鼠的抑制作用。方法將60只雌性C57BL/6小鼠隨機分為3組：正常對照組、EAE組、EAE+依達拉奉組，每組20只。正常對照組用PBS作為對照。后兩組應用髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35-55、完全福氏佐劑(CFA)、結核分枝桿菌，制成的抗原乳劑進行造模。免疫2 d后，EAE+依達拉奉組腹腔注射依達拉奉5 mg/(kg·d)。3組均監測20 d，每日稱重，觀察小鼠的攝食和發病情況，并進行神經功能評分。20 d后取小鼠脊髓組織，進行病理學觀察。結果EAE組小鼠的發病率(80%)高于EAE+依達拉奉組(45%)，差異有統計學意義(P<0.05)。EAE+依達拉奉組神經功能評分各個時間點都低于EAE組，差異有統計學意義(P<0.05)，其中，監測10 d后，EAE組神經功能評分(3.6±0.4)級；而EAE+依達拉奉組評分為(1.3±0.5)級。HE染色后發現，EAE組小鼠的脊髓內有大量的炎性細胞浸潤，白質脫髓鞘改變明顯。而EAE+依達拉奉組小鼠有較少的炎性細胞浸潤，且沒有白質脫髓鞘改變。結論依達拉奉對EAE的保護作用可能與其清除自由基、減輕炎性反應有關。

依達拉奉；實驗性自身免疫性腦脊髓炎；多發性硬化

多發性硬化(multiple sclerosis, MS)是發生在中樞神經系統的自身免疫性脫髓鞘疾病，多次反復發作或病程進展迅速可導致運動障礙，最終全身癱瘓[1]。該病病因和發病機制尚不明確，近年來越來越多的研究表明，自由基損傷可能與MS的發病密切相關[2]。依達拉奉是一種新型的自由基清除劑，一方面具有直接清除自由基、減輕血腦屏障破壞等作用；另一方面能通過抑制次黃、黃嘌呤氧化酶的活性，減少炎性介質白三烯等的生成，并抑制遲發性神經元死亡[3]。本研究通過建立實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)模型，給予依達拉奉注射液進行干預，觀察小鼠的發病率、神經功能損傷情況及病理學改變，探討依達拉奉對EAE小鼠的抑制作用，為臨床治療干預MS提供新思路、新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原及藥物 免疫抗原MOG35-55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)由美聯(西安)生物科技有限公司合成，經質譜及HPLC色譜分析，純度>95%，完全福式佐劑(CFA, Sigma)與百日咳毒素(PT)均購自上海生物制品研究所。

1.1.2 實驗動物 雌性C57BL/6小鼠60只，4～6周齡，體重11～15 g。清潔級，以標準飼料喂養，飲用自來水，環境恒溫20～25 ℃。購自上海斯萊克實驗動物有限公司。合格證號：SCXK(滬)2007000532247。

1.2 方法

1.2.1 分組及EAE模型的建立 60只小鼠隨機分為：正常對照組、EAE組和EAE+依達拉奉組3組，每組20只。用0.01 mol/L的磷酸緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)將MOG35-55稀釋成300 μg/ml，再用完全福氏佐劑(CFA)將結核分枝桿菌稀釋成4 mg/ml。用注射器抽打至油包水狀態，制成誘導EAE的抗原乳劑。正常對照組用PBS作為對照，EAE組、EAE+依達拉奉組小鼠分別腹股溝皮下注射相應抗原，100 μl/只，記免疫當天為0 d，于0、2 d給予小鼠腹腔注射百日咳毒素200 μl/只。免疫后2 d，給予EAE+依達拉奉組小鼠腹腔注射依達拉奉5 mg/(kg·d)，1次/d，連續給予20 d。

1.2.2 體質量監測及神經功能評分 免疫當天開始，每日稱重，觀察小鼠的攝食和發病情況，并進行神經功能評分，連續觀察20 d。神經功能評分標準為通用的0～5級評分法：0級，不發病；1級，小鼠尾部張力降低或麻痹；2級，小鼠尾部麻痹，后肢無力；3級，小鼠后肢癱瘓；4級，小鼠四肢癱瘓，人為翻身不能復位；5級，瀕死狀態或發病后死亡[1]。

1.2.3 組織取材與病理學檢查 自免疫后20 d，腹腔注射2%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉各組所有小鼠，在無菌條件下剖開胸腔，暴露心臟，經左心室灌注PBS至肝臟變白，然后改用4%多聚甲醛灌注固定，隨后立即取出腦和脊髓浸入甲醛中固定。常規石蠟包埋后制成5 μm厚的切片，HE染色，并在光鏡下觀察炎性細胞浸潤及脫髓鞘改變[1]。

2 結 果

2.1 發病率及臨床表現 正常對照組無一只發病。EAE組發病 16 只，發病率80%；EAE+依達拉奉組發病9只，發病率 45%；兩組比較，差異有統計學意義(P=0.023)。后兩組發病開始于免疫后8 d，約在10 d達到發病高峰。主要表現為食欲下降、體重減輕。同時，EAE組小鼠中樞神經系統受損癥狀明顯，表現為尾部無力拖垂，步履蹣跚，后肢癱瘓，行動困難，病情進一步發展表現為四肢癱瘓。

2.2 神經功能評分 免疫后20 d內EAE組和EAE+依達拉奉組神經功能評分見表1，兩組均在免疫后8 d評分開始增高，并隨著免疫時間的延長，評分逐漸升高，16 d后，評分開始下降。與EAE組比較，EAE+依達拉奉組在不同時間的評分均低，差別有統計學意義(P<0.05)。EAE組小鼠最高神經功能評分為4級，10 d時評分為(3.6±0.4)級；EAE+依達拉奉組最高為3級，10 d時評分為(1.3±0.5)級。

表1 免疫后兩組小鼠的神經功能評分 ±s；級)

注：4、6 d的評分兩組均為0

2.3 病理學檢查 正常對照組小鼠脊髓未見明顯異常。EAE組小鼠脊髓的實質中有大量的炎性細胞浸潤，以淋巴細胞和中性粒細胞為主，病變主要集中在脊髓腰膨大的白質區，在白質區可見大小不等的髓鞘脫失區，而且髓鞘脫失區程度與EAE小鼠的臨床癥狀的嚴重程度直接相關。而EAE+依達拉奉組小鼠脊髓的實質中僅有少量的炎性細胞浸潤，且沒有髓鞘脫失。結果見圖1。

圖1 小鼠脊髓組織的病理檢查結果(HE)

3 討 論

MS是一種中樞神經系統脫髓鞘疾病，以青、中年多見，臨床特點是病灶播散廣泛，病程中常有緩解復發的神經系統損害癥狀，目前尚無特殊治療方法，且往往預后不佳。EAE小鼠模型是公認的MS動物模型[4]，本研究中，EAE組小鼠自免疫后8 d開始發病，約在20 d達到發病高峰，最高神經功能評分為4級。

依達拉奉是一種腦保護藥(自由基清除劑)，大量研究證實其對缺血動物實驗模型有清除自由基、抗腦水腫、縮小梗死體積及改善神經功能等保護作用[5-9]。作為新型自由基清除劑、抗氧劑，已廣泛應用于急性腦梗死的治療中。文獻[10]提示，依達拉奉可清除自由基，抑制脂質過氧化，從而抑制腦細胞、血管內皮細胞、神經細胞的氧化損傷。

本研究中，EAE組的神經功能缺損程度最嚴重，細胞形態學顯示脊髓組織多可見大量炎性病灶，以淋巴細胞和巨噬細胞為主。在使用依達拉奉干預后，神經功能缺損程度減輕，血管周圍炎性浸潤細胞數減少，且細胞學形態改善更明顯，結果顯示依達拉奉對EAE具有神經保護作用。經依達拉奉干預后，EAE+依達拉奉組小鼠的發病率為45%，明顯低于EAE組。

本研究結果表明，依達拉奉能減輕EAE病情嚴重程度，改善病變區域病理形態學表現，對EAE具有保護作用，其保護作用可能與其清除自由基、減輕炎性反應有關。本研究對依達拉奉治療MS 提供了新的思路。

[1] 關東升,高 穎,朱陵群. C57BL/6小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型的建立及病理特征[J]. 中國實驗動物學報, 2008, 6(16)：406-409.

[2] Gonsette R E. Oxidative stress and excitotoxicity: a therapeutic issue in mutiple sclerosis?[J]. Mult Scler, 2008, 14(1): 22-34.

[3] 張巧蓮,郭 力,胡巖芳, 等. Nrf2和HO-1在實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓中的動態表達及依達拉奉保護機制的研究[J]. 中國免疫學雜志, 2010，26(6)：514-519.

[4] Robinson A P, Harp C T, Noronha A,etal. The experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment [J]. Handb Clin Neurol, 2014, 122: 173-189.

[5] 湯 熠,魏 偉,魏麓云. 依達拉奉對大鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎的保護作用[J]. 現代生物醫學進展, 2011, 11(4)：680-683.

[6] 董 梅,張美月,陳 欣，等. Th17細胞在實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠發病中的表達及依達拉奉的保護作用研究[J]. 中國免疫學雜志, 2013, 29(2): 140-143.

[7] 梁江紅,陳 琳. 依達拉奉對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠的保護作用[J]. 現代診斷與治療，2012, 23(8): 1116-1117.

[8] 徐鋆陽, 徐鋆耀, 王念蓮, 等. 依達拉奉對腦復蘇患者血清神經元烯醇酶(NSE)的影響[J]. 中國急救復蘇與災害醫學雜志, 2012, 7(3):240-243.

[9] 金可國, 李曉琴, 劉海燕. 依達拉奉治療椎-基底動脈缺血性眩暈256例分析[J]. 中國急救復蘇與災害醫學雜志, 2012,7(12):1164-1165.

[10] Moriya M, Nakatsuji Y, Miyamoto K,etal. Edaravone, a free radical scavenger, ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis [J]. Neurosci Lett, 2008, 440(3): 323-326.

(2014-02-05收稿 2014-04-10修回)

(責任編輯 武建虎)

Inhibitingeffectofedaravoneonexperimentalautoimmuneencephalomyelitisinmice

ZHENG Huimin1, LIU Shijun1, SUN Keming1, LIU Xianyong1，and GUO Junqing2. 1. Department of Pharmacy, Shandong Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Jinan 250014, China；2. Outpatient Department of Shandong Provincial Corps, Chinese People’s Armed Police Forces, Jinan 250014, China

ObjectiveTo study the inhibiting effect of edaravone on experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mouse model.MethodsSixty female C57BL / 6 mice were randomly divided into three groups: normal control group, EAE group, EAE + edaravone group (n=20), normal control group with PBS as a control. The application of myelin oligodendrocytes glial cells glycoprotein 35-55 and complete Freund’s adjuvant (CFA) and Mycobacterium tuberculosis antigens emulsions were made modeling in the later two groups. After 2 days immunization, EAE+edaravone group were injected at a dose of 5 mg/(kg·d) of edaravone. Three groups were monitored 20 days, daily weighing, feeding and incidence were observed, and neurological function was scored. Mouse spinal cord tissue was obtained for pathological examination after 20 days.ResultsIn EAE+edaravone treated mice, compared with EAE mice, the incidence and neurological function scores were significantly low (P<0.05). The incidence in EAE group was 80%, while the incidence in EAE+ edaravone group mice was 45%. Monitored for 10 days, in EAE group mice, neural function score was 3.6±0.4, while in EAE+ edaravone group mice neural function score was 1.3±0.5. HE staining found a large number of inflammatory cell infiltration in EAE mice spinal cord, and white matter demyelination was obvious. Nevertheless edaravone group mice had fewer inflammatory cell infiltration, and no white matter demyelination.ConclusionsProtective effect of edaravone on EAE is related to scavenging free radicals and reducing inflammation.

edaravone; experimental autoimmune encephalomyelitis; multiple sclerosis

鄭慧敏，碩士，主管藥師，E-mail: zhm1216@126.com

1.250014濟南，武警山東總隊醫院藥劑科；2.250014濟南，武警山東總隊機關門診部

R593.2