人肝癌多藥耐藥細胞系Bel-7402/DOX兩種模型比較

鐘興國，龔仁華，孫登群，曹葆強，范育林，姜世濤，蔡 軍，何新苗，駱會來

人肝癌多藥耐藥細胞系Bel-7402/DOX兩種模型比較

鐘興國，龔仁華，孫登群，曹葆強，范育林，姜世濤，蔡 軍，何新苗，駱會來

目的比較體外濃度梯度遞增誘導和裸鼠肝臟移植誘導兩種方法建立人肝癌多藥耐藥細胞系Bel-7402/多柔比星(Doxorubicin,DOX)模型的生物學特性。方法分別采用體外濃度梯度遞增誘導和裸鼠肝臟移植誘導建立人肝癌多柔比星多藥耐藥細胞亞系Bel-7402/DOXV和Bel-7402/DOXL后，利用相差顯微鏡觀察細胞，MTT法檢測兩種細胞的耐藥性，細胞計數法繪制生長曲線并用公式法計算倍增時間，流式細胞儀測定細胞DOX的攝入和外排以及P糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關蛋白(MRP)、谷胱甘肽硫轉酶系統(GSH/GST)的表達。結果兩組耐藥細胞Bel-7402/DOXV和Bel-7402/DOXL對DOX、CDDP均產生了交叉耐藥性，較親本Bel-7402 IC50值差異有統計學意義(P<0.01)；較親本細胞的倍增時間明顯延長，分別為65 h和46 h；較親本的DOX外排率明顯升高，分別為81.06%、66.56%；兩組耐藥細胞P-gp、MRP表達較親本細胞顯著提高(P<0.01)，而GSH/GST的表達無明顯變化。結論兩種方法建立的耐藥細胞系模型均有穩定的耐藥性。肝臟移植法更能高度模擬人肝癌, 它是具有近似人肝癌生物學和抗癌藥物動力學特征的較理想模型。

肝癌；多藥耐藥；多柔比星；細胞系模型

目前對于肝癌，尤其是對中晚期肝癌的治療仍以手術及化療相配合治療為主。化療在肝癌的治療中仍占有重要地位。但是肝癌細胞對多種化療藥物產生的多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)是肝癌治療的瓶頸，因此針對耐藥及其逆轉策略是目前肝癌研究的熱點之一。建立可靠的腫瘤MDR模型，是研究腫瘤MDR及其逆轉的基礎。本研究用多柔比星(Doxorubicin,DOX)通過兩種常用方法建立人肝癌Bel-7402/DOX耐藥細胞株，比較兩者的生物學特性，從而獲得較理想的耐藥模型，為最終揭示臨床MDR現象的本質和篩選逆轉劑進行有益的探索。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞株Bel-7402購自上海生物研究所。4周齡BALB/c-nu/nu裸小鼠，質量12～16 g，購自上海斯萊克公司，飼養于中國科技大學生命科學院SPF動物中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 裸小鼠肝臟移植方法建立MDR細胞模型 4～6周齡雄裸小鼠共10只，水合氯醛(430 mg/kg)腹腔注射麻醉后，劍突下做一橫切口，用1 ml注射器將0.2 ml Bel-7402細胞懸液(密度為1×108/ml)注入肝右葉實質內，關腹。隨機分為肝原位移植瘤實驗組(5只)和對照組(5只)2組，飼養于SPF條件下。于第3天開始實驗組裸鼠分別予以DOX 1.5 mg/kg腹腔內注射，每周1次，共8周；對照組均腹腔注射等量的生理鹽水。每天觀察記錄裸鼠的皮膚、反應、食欲及精神狀態。腫瘤體積計算公式：V=πab2/a(a為腫瘤長徑，b為腫瘤短徑)。實驗結束時處死裸鼠，取出瘤體，無菌下碾碎，以0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞2～3 min制成單細胞懸液，分別接種于25 ml無菌培養瓶中原代培養、多次傳代純化后即獲得肝臟移植耐藥細胞株Bel-7402/DOXL(liver-implanted induction)。電鏡觀察標本處理：腫瘤細胞株以1%鋨酸固定，樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和枸緣酸鉛雙重染色后，ZEISS-902型透射電鏡下觀察。

1.2.2 體外誘導建立MDR模型 采用DOX濃度梯度遞增誘導法，取對數生長期Bel-7402細胞5×105/ml接種于25 ml 培養瓶中，培養24 h后將培養液換為含低濃度的多柔比星(DOX 0.01 μg/ml)培養液，繼續培養24 h后棄含藥培養液，0.25%胰酶消化，1000 r/min離心3 min，收集細胞，按1×105/ml加入25 ml培養瓶重新接種，加不含藥培養液，繼續培養。待細胞生長狀態良好，進入對數生長期(約2周)時提高藥物濃度，提高的幅度使細胞存活60%～70%為宜。如此反復(周期約半年)，直到細胞能在含0.5 μg/ml多柔比星的培養液中穩定生長增殖，將該細胞亞系命名為Bel- 7402/DOXV(vitro induction)。

1.2.3 MTT法檢測細胞對藥物的敏感性 取對數期3組細胞(親本及兩組耐藥細胞)制備細胞懸液，調整細胞濃度為5×105/ml，接種至96孔培養板，每孔200 μl(相當于105個細胞)，培養24 h后加入試驗藥物DOX、CDDP、MMC、MTX、5-FU。藥物濃度參照各藥臨床用量的血峰濃度，上下各浮動103倍，設7個試驗濃度，即103、102、101、100、10-1、10-2、10-3倍血峰濃度，另設不加藥的對照組，每個實驗濃度設置5個復孔。37 °C、5%CO2繼續培養24 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)溶液20 μl，繼續培養4 h，棄上清液終止培養，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，上酶標儀，于波長為570 nm(校正波長為630 nm)處測定光密度(OD)值，計算細胞存活率。公式: 細胞存活率=(實驗孔OD值/對照孔OD值)×100%。繪圖法測定藥物的半數抑制濃度(IC50)。耐藥指數(resistance index, RI)=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。MTT試驗在不同日重復3次。

1.2.4 生長曲線繪制及倍增時間測定 取生長狀態良好的3組細胞，用RPMI 1640完全培養液制備細胞懸液(5×103/ml)，接種至六孔板中(1 ml/孔)，至少接種21 孔，分別于接種后1、2、3、4、5、6、7 d，每天取3孔進行細胞計數，結果取均值，以培養時間為橫坐標，細胞數為縱坐標繪制生長曲線，按Patterson公式計算細胞倍增時間: Td=tlg2/lg(Nt/N0)。Td，倍增時間(h)；t，細胞數由N0增至Nt所需的時間；N0，接種時的細胞數；Nt，培養t小時后的細胞數。

1.2.5 DOX的攝入和外排 采用流式細胞術測定細胞內DOX的熒光強度，間接反映其濃度。取對數生長期3組細胞制細胞懸液(1×106/ml)，加DOX至終濃度為4.0 μg/ml，CO2培養箱中放置20 min，取1 ml離心，冷PBS洗2次，重懸于0.5 ml PBS中，立即上流式細胞儀檢測DOX的相對熒光強度(激發波長479 nm，發射波長587 nm)。在外排實驗中，將上述細胞離心后用冷的RPMI-1640培養液冼滌，重懸于無藥培養液，在CO2培養箱中放置60 min，離心，PBS冼滌，檢測細胞內多柔比星相對熒光強度，方法同前。以DOX的外排率反映細胞對DOX的外排功能。DOX外排率= (攝入值-滯留值)/攝入值×100%(試驗在不同時間重復5次)。

1.2.6 流式細胞儀測定P糖蛋白(P-gp) 、MDR相關蛋白(MRP)及谷胱甘肽硫轉酶系統(GSH/GST)的表達 取對數生長期耐藥細胞及親本細胞 (1×108/ml) 3組，每組5管，PBS(4 ℃, 0.01 mol/L, pH7.4)清洗2遍，分別加入MRK16(MDR1)、MRPrl(MRP)、GSH/ GST鼠抗人單克隆抗體，以鼠抗人isotype-matched單克隆抗體作為對照，4 ℃孵育1 h，分別加入羊抗鼠熒光標記IgG，4 ℃孵育30 min后于流式細胞儀上進行熒光測定。

2 結 果

2.1 肝臟移植瘤耐藥模型 肝臟移植瘤10只裸鼠均接種成功，實驗組腫瘤平均生長速度約(3.50±0.37)mm3，對照組平均每天生長(3.70±0.41)mm3。在8周飼養及給DOX誘導的過程中，各組生長均良好，皮膚紅潤。實驗組中有2只發生腹水，無惡病質，無死亡記錄。8周后處死全部裸鼠，觀察：實驗組和對照組移植瘤大體形態無差異，呈橢圓形或分葉狀，平均瘤重(1.48±0.21)g，腫瘤周圍纖維組織包裹明顯，瘤體切面呈灰白色，少數呈散在簇狀分布。實驗組有3只腹腔轉移(圖1)。

圖1 肝臟移植瘤及體外瘤

2.2 細胞形態學觀察 相差顯微鏡下觀察Bel-7402細胞呈梭形，排列緊密、大小均勻、邊界清楚、貼壁生長。加入藥物后大部分細胞凋亡、溶解，存活的細胞大小不等，細胞輪廓欠清晰，附壁力下降，約兩周后恢復生長，上述急性期變化消失。耐藥細胞形態均不規則，體積稍增大，易堆積生長，胞漿內出現大量的顆粒和空泡，細胞核略皺縮。電鏡觀察：腫瘤細胞與人肝癌相似，移植的肝癌細胞核大、核仁深染、核膜有許多切跡(圖2)。

圖2 原位移植的肝癌細胞電鏡照片(×10 000)

2.3 兩種細胞對抗癌藥的敏感性 兩種耐藥細胞亞系對DOX、CDDP都產生了交叉耐藥性，對MMC、MTX和5-FU無交叉耐藥(表1)。

表1 Bel-7402/DOXL和Bel-7402/DOXV細胞對多種化療藥物的敏感性 (n=5；±s)

注：與Bel-7402比較，①P<0.05；與Bel-7402/DOXL比較，②P<0.05

2.4 生長曲線與倍增時間 耐藥細胞較親本細胞的倍增時間明顯延長，Bel-7402、Bel-7402/DOXL和Bel-7402/DOXV倍增時間分別為39 h、46 h和65 h(圖3)。

圖3 人肝癌多藥耐藥細胞系Bel-7402/DOX細胞生長曲線

2.5 DOX的攝入和外排 各組細胞外排DOX后相對熒光強度均降低，耐藥細胞較親本更為明顯, Bel-7402/DOXV對DOX的外排率最高，為(81.06±0.20)%(表2)。

表2 各細胞DOX攝入和外排后的相對熒光強度 (n=5；±s)

注：與Bel-7402比較，①P<0.05；與Bel-7402/DOXL比較，②P<0.05

2.6 P-gp、MRP、GSH/GST表達的變化 兩組耐藥細胞的P-gp、MRP表達較親本均明顯提高(P<0.01)，GSH/GST的表達在3組中比較，差異均無統計學意義(表3)。

表3 流式細胞儀分析P-gp、MRP及GSH/GST熒光細胞染色率 (n=5；

注：與Bel-7402比較，①P<0.05；與Bel-7402/DOXL比較，②P<0.05

3 討 論

手術切除仍是肝癌治療的最佳選擇[1,2]。但是肝癌早期診斷率低，病情發展快，約60%以上肝癌確診時已經發生臨床或鏡下轉移[3]，因此化療等非手術治療比手術治療更有實用價值，但MDR的存在嚴重影響了肝癌的化療效果，而進行這方面的研究離不開建立可靠的MDR細胞模型[4]。目前，人肝癌細胞MDR模型的建立多采用體外培養誘導腫瘤MDR、MDR基因轉染及裸鼠移植模型誘導耐藥等方法。體外培養誘導腫瘤MDR又包括藥物濃度梯度遞增法、高濃度藥物間歇誘導法兩種[5,6]。裸鼠體內移植誘導耐藥方法包括皮下移植、肝臟移植和腹腔移植三種。各種方法各有優缺點，本實驗旨在篩選哪種耐藥細胞系是研究肝癌耐藥機制的理想模型，為后續研究耐藥本質及逆轉奠定基礎。

導致腫瘤細胞MDR的原因主要與P-gp、MRP、LRP、GST、谷胱甘肽和谷胱甘肽S-轉移酶、蛋白激酶C、調亡相關基因(bcl-2、c-myc、p53)、GCS的高表達、癌細胞生活環境及DNA拓撲異構酶Ⅱ活性的改變等有關[7]。由于腫瘤的耐藥機制錯綜復雜， MDR細胞耐藥表型具有細胞特異性，誘導藥物、誘導方式不同，所得耐藥表型不盡一致。本實驗將兩種常用方法建立的兩種人肝癌多柔比星MDR細胞亞系模型進行比較。總結如下：

兩種耐藥細胞在形態學方面均呈不規則，體積比親代稍增大，生長速度變慢，易堆積生長，細胞膜邊界模糊，胞漿內出現大量的顆粒和空泡，細胞核略皺縮。體外誘導耐藥細胞差異較明顯，體內移植誘導耐藥細胞形態接近于親本。

濃度梯度遞增法建立的耐藥細胞模型具有更高的耐藥倍數，兩者對DOX的RI分別為112.88和22.45，對CDDP的RI分別為13.73和25.69，兩種細胞對MMC、MTX和5-FU無交叉耐藥，因此提示體外濃度梯度遞增法更容易使細胞產生耐藥表型。兩種耐藥細胞較親本細胞的倍增時間均明顯延長，倍增時間分別為39 h、46 h和65 h，可以看出體外濃度梯度遞增法耐藥細胞系生長速度及增殖能力明顯低于體內誘導法。

在耐藥機制方面，藥物外排泵介導的藥物外排增多是最常見的耐藥機制之一[8]。本研究顯示，親本及二者對DOX的外排率分別為34.14%、66.56%和81.06%，耐藥細胞對DOX的外排率明顯增高，表現為藥物的滯留減低，從而使細胞內的藥物濃度減低，減少藥物對細胞靶器官的損傷，推測這是導致其耐藥指數較高的主要原因。

兩組耐藥細胞P-gp、MRP的表達較親本均顯著提高，而GSH/GST的表達在兩組中比較差異均無統計學意義。提示P-gp高表達可能造成細胞內DOX藥物蓄積減少，從而構成耐藥性的一個分子基礎；MRP過度表達可能是造成細胞耐藥性的另一分子基礎。而肝癌細胞耐藥性的形成與GSH/GST的表達無明顯關系。

本研究發現，體外濃度梯度遞增法建立的耐藥細胞模型優勢是耐藥指數及穩定性均較高，但缺點在于細胞增殖能力低，同時誘導耐藥過程耗時長，一般需要6個月左右時間，誘導過程也很容易引起污染。裸鼠體內誘導法建立的耐藥模型優勢在于細胞有較強的增殖能力，誘導過程短，一般為8周左右，且污染可能性小，缺點是耐藥性及穩定性稍差。

綜上所述，在兩種建模方法中，裸鼠體內肝臟誘導法建立的耐藥模型較為理想。首先，具備較穩定的耐藥性。其次，能較準確反映臨床耐藥的形成過程。此建模方法與化療過程中的給藥方法非常接近，即都是在活體內短時間注入大劑量化療藥物，達到一定的血藥濃度殺死癌細胞。臨床上為減輕化療藥的不良反應，提高療效，常使用大劑量短程給藥方法[9]。再者，與臨床耐藥細胞相似，它們均有較強的增殖能力。因MDR形成而導致化療失敗的患者最終將出現原發灶的復發或轉移[10]，這提示在臨床上出現的耐藥細胞具有較強的增殖和轉移能力，是在藥物的作用下而選擇出的有更強生存優勢的腫瘤細胞群體，這類細胞能克服化療藥的抑制而正常生長增殖。此外，誘導過程短，污染可能性小，操作相對簡單，也是其一大優點。

[1] Zhou X D, Tang Z Y, Yang B H,etal. Experience of 1000 patients who underwent hepatectomy for small hepatocellular carcinoma [J]. Cancer, 2001, 91(8):1479-1486.

[2] Yang J M, Kan T, Chen H,etal. Hepatectomy in the treatment of very big primary liver cancer:report of 86 cases[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2002, 1(1): 42-45.

[3] Pignata S, Daniele B, Gallo C,etal. Endocrine treatment of hepatocellular carcinoma, any evidence of benefit[J]. Eur J Cancer, 1998, 34(1): 25-32.

[4] Urasaki Y, Ueda T, Yoshida A,etal. Establishment of a daunorubicin-resistant cell line which shows multi-drug resistance by multifactorial mechanisms [J]. Anticancer Res, 1996, 16(2): 709-714.

[5] Yang L Y, Trujillo J M. Biological characterization of multidrug-resistant human colon carcinoma sublines induced/selected by two methods [J]. Cancer Res, 1990, 50: 3218-3225.

[6] Gottesman M M, Fojo T, Bates S E. Multidrug-resistance in cancer: role of ATP- dependent transporters [J]. Cancer, 2002, 2(1): 45-48.

[7] Sun Y L, Zhou G Y, Li K N,etal. Suppression of glucosyceramide synthase by RNA interference reverses multidrug resistance in human breast cancer cells [J]. Neoplasma, 2006, 53(1): 1-8.

[8] Ejendal K F, Hrycyna C A. Multidrug resistance and cancer: the role of the human ABC transporter ABC G2 [J]. Curr Protein Pept Sci, 2002, 3(5): 503- 511.

[9] Eckhardt S. Recent progress in the development of anticancer agents [J]. Curr Med Chem Anti Canc Agents, 2002, 2(3): 419-439.

[10] Choi J H, Lim H Y, Joo H J,etal. Expression of multidrug resistance-associated protein1, P-glycoprotein, and thymidylate synthase in gastric cancer patients treated with 5-fluorouracil and doxorubicin-based adjuvant chemotherapy after curative resection [J]. Br J Cancer, 2002, 86(10): 1578-1585.

(2014-02-28收稿 2014-04-17修回)

(責任編輯 武建虎)

本刊“臨床病例討論”欄目征稿通知

為了貫徹“面向部隊，服務基層”的辦刊宗旨，加強不同層次醫療機構臨床實踐交流，幫助基層醫師學習和了解先進教學醫院和知名專家對疾病的臨床診治思路,提高基層衛生機構的臨床業務水平。本刊于2012年開辟“臨床病例討論”欄目，報道武警部隊各級醫院及重點學科臨床工作中遇到的疑難和典型病例，以及基層衛生隊經過多學科專家遠程會診得以成功治療的典型病例。會診專家需署名(如無外請專家，也可署本院科主任名)，格式如：張某某醫師(肝膽科)。具體行文格式參考本欄目已發表的論文格式。全文字數3800或6500左右。 來稿請在右上角標注“臨床病例討論”。本欄目所錄稿件為原創性臨床研究論文，歡迎廣大臨床醫師踴躍投稿！

武警醫學編輯部

2014年1月

Comparisonofmulti-drugresistanthumanhepatocellularcarcinomacelllineBel-7402/DOXmodelestablishedbytwomethods

ZHONG Xingguo, GONG Renhua, SUN Dengqun, CAO Baoqiang, FAN Yulin, JIANG Shitao, CAI Jun, HE Xinmiao, and LUO Huilai. Department of General Surgery, Anhui Provincial Corps Hospital，Chinese People’s Armed Police Forces, Hefei 230041, China

ObjectiveTo compare the biological characteristics of two types of human hepatocellular carcinoma multi-drug resistant cell sub-lines Bel-7402/DOX models established by two methods.MethodsWe established human hepatocellular carcinoma doxorubicin multi-drug resistant cell sub-lines models Bel-7402/DOXV and Bel-7402/DOXL by in vitro concentration gradient increased induction and nude mice liver-implanted induction, respectively. Phase contrast microscopy was used to observe the cells and MTT (methyl thiazolyl tetrazolium) method was used to detect drug resistance of the two different sub-lines of cells. The ingestion and excretion of cellular doxorubicin (DOX) and the expression of P-glycoprotein (P-gp), multi-drug resistance-sociated protein (MRP) and glutathione S-transfer enzyme system (GSH/GST) were detected by flow cytometry.ResultsThe Bel-7402/DOXV and Bel-7402/DOXL generated cross-resistance to DOX and CDDP (cis-Diaminedichloroplatinum), they showed a significant difference in resistance to Bel-7402 IC50 value (P<0.01). The doubling times were significantly extended, compared with the parent cell line (39 h), and were 65 h (Bel-7402/DOXV) and 46 h (Bel-7402/DOXL). The excretion rates of DOX were significantly increased, compared with the parent cell (34.14%) line and were 81.06% (Bel-7402/DOXV) and 66.56% (Bel-7402/DOXL). Expressions of P-gp and MRP in the two groups of resistant sub-lines cells were significantly enhanced (P<0.01). There was no significant variation in the expression of GSH/GST (P>0.05).ConclusionsStable resistance is involved in the resistant cell line model established by the two methods above. Liver implantation is a good simulation of human hepatocellular and proves to be an ideal model with characteristics similar to human hepatocellular biology and the pharmacokinetics of anticancer drugs.

hepatocellular carcinoma; multidrug resistance; doxorubicin; cell line model

安徽省自然科學基金(1208085MH181)

鐘興國，碩士，副主任醫師，副教授，E-mail：zhongxg75@163.com

230041合肥，武警安徽總隊醫院普外科

R735.7