建立科研型肝癌肝移植標本庫質量控制體系的初步探討

王樂天，張 慶，郝昱文，陳 虹，陳新國，沈中陽

建立科研型肝癌肝移植標本庫質量控制體系的初步探討

王樂天1，張 慶1，郝昱文2，陳 虹1，陳新國1，沈中陽1

目的 探討建立科研型肝癌肝移植臨床標本庫質量控制體系，制定規范化的肝癌肝移植標本采集、處理、保存操作流程及標本信息化管理系統。方法 借鑒國內外建立標本庫的標準化程序，制定肝癌肝移植標本庫操作流程及質量控制體系，規范化收集、處理及保存肝癌肝移植受者的腫瘤組織及血液標本，同時收集良性肝病肝移植受者以及健康供者的肝組織及血液標本作為研究對照。對所收集的標本及相關的臨床資料信息進行系統化管理。結果 自2009-08肝癌肝移植標本庫現收集有完整臨床資料的501例肝移植供、受者的組織及術前/術后血液標本。其中，肝癌標本包括腫瘤組織、癌旁組織及遠端非癌組織標本共計1773份。隨機抽取45例標本進行質量監測，顯示標本取材的準確率達90%以上，標本質量較好。開發了規范化的標本信息資料計算機管理系統。結論 初步建立了具有一定規模的科研型肝癌肝移植標本庫質量控制體系，有利于提高標本的質量，為肝移植研究提供了規范化的臨床樣本資源平臺。

肝細胞肝癌；肝移植；生物樣本庫；規范化收集；信息化管理

我國是肝癌高發區，患者就診時多伴有肝炎相關肝硬化。肝移植是目前唯一同時治療肝癌和肝硬化的有效手段[1,2]。但移植術后肝癌的復發和轉移制約了肝移植的發展，深入研究攻克肝癌肝移植術后復發和轉移難題勢在必行。建立規范化的肝癌肝移植標本庫可以最大限度地保護并合理利用肝癌組織標本資源，提供臨床標本資源平臺，促進肝癌肝移植的研究。鑒于國內尚未建立規范的科研型肝癌肝移植標本庫，我們自2009年利用我院肝移植規模處于國內前列的優勢，標準化地收集和保存了肝癌肝移植供者和受者的標本。受者的病肝標本包括肝癌組織、癌旁組織、遠端非腫瘤組織，并建立了與肝癌標本相關的臨床診治、術后隨訪等資料及知情同意等倫理資料的信息管理系統，從而初步建立了符合國際規范的肝癌肝移植臨床樣本庫，為肝癌肝移植研究提供了寶貴的臨床樣本資源。

1 對象與方法

1.1 對象 均為自2009-08在我院住院等待實施肝移植的肝癌患者及終末期良性肝病患者(包括乙肝或丙肝合并肝硬化、自身免疫性肝病、酒精性肝硬化、急性肝衰竭、肝豆狀核變性、布加綜合征等)。全部病例均經臨床化驗檢查及病理學檢查明確診斷。標本庫由病理技術員專人負責，熟悉收集流程、熟練掌握標本處理操作規范及質量控制方法。

1.2 主要設備 -86 ℃超低溫冰箱 (海爾 DW-86L626 型，規格箱內溫度范圍-40～-86 ℃，溫度波動值≤6 ℃),-40 ℃冰箱(海爾DW-40L262型，規格：箱內溫度范圍-20～-40 ℃)，6升的液氮罐(YDS-6，靜態液氮保存天數≥53 d，四川東亞液氮罐廠),全自動脫水機(規格型號：VIP-6 ，日本櫻花SAKURA公司)、石蠟包埋機(規格型號：5232 TEC 5 EM J-2，日本櫻花SAKURA公司)、凈化工作臺(規格型號：SW-CJ-2FD、潔凈等級：100級@≥0.5 μm， 蘇州凈化設備有限公司)、L500低速自動平衡離心機(L500型，規格：最高轉速 5000 r/min，總功率 200 W，最短加/減速時間 30 s/25 s，最大相對離心力 4030 g，長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

1.3 主要試劑 血液、組織DNA提取試劑盒(德國QIAgen試劑盒)、淋巴細胞分離液(上海恒信化學試劑有限公司產品)、無水乙醇(北京化工廠)、RNAase (美國Omega公司)等。

1.4 標本收集前的準備 肝移植術前征得患者及其家屬知情同意,簽署知情同意書。由科室住院總醫師負責確定標本收集的研究對象及通知采集時間。組織標本由專門負責標本庫的病理技術員進行采集，并負責提前準備標記好的凍存管、留取血清和血漿的醫用采血管、轉移式液氮罐、不銹鋼標尺、10%甲醛溶液、照相機、標本資料表等工作。組織標本采集工作在手術室進行，采集器械由手術室提供。

1.5 標本的規范化收集與貯存

1.5.1 新鮮凍存標本收集、處理及保存 當肝癌肝移植受者的完整病肝組織切除離體后，立即用數碼相機拍攝大體標本外觀(包括標尺，顯示肝癌的大小等)，在病肝組織離體后30 min內，除首先留取保證用于病理科進行診斷的足夠量腫瘤及癌旁組織標本，將剩余病肝組織按癌組織、癌旁組織(距離腫瘤組織2 cm)和切緣遠端非癌組織(距離腫瘤組織>5 cm左右)進行多位點采集。健康供肝組織的標本采集需保證供肝質量及完整性的前提下進行獲取，原則上按肝穿活檢的組織大小(直徑約0.2 cm)在肝邊緣處(血管分布較少區域)切取。

1.5.1.1 凍存標本HE染色 HE染色主要用于診斷和檢驗切取的標本質量是否合格。冷凍樣本室溫下解凍后脫水、石蠟包埋，制成切片進行HE染色，顯示腫瘤組織面積大于70%以上者為合格標本。

1.5.1.2 提取DNA的凍存標本 每例患者的每種組織(癌、癌旁及遠端非癌組織)平均切成3～6份標本(根據腫瘤大小)，每份標本的重量原則上在2.5 g左右(直徑約0.5 cm，厚度約0.5 cm)， 分別裝入2 ml已滅菌標記的凍存管中，并迅速置于轉移式液氮罐中，于30 min內再轉入-80 ℃超低溫冰箱中長期保存。

1.5.1.3 提取RNA的凍存標本 在切取組織(切取組織大小依據病肝腫瘤體積)的時候，為防止 RNA 降解，需快速取下組織，將每塊組織用滅過菌的 DEPC水溶液快速沖洗后，迅速裝于用0.1%的DEPC水處理過高溫滅菌的2 ml凍存管中，快速置于轉移式液氮中。于30 min內再轉入-80 ℃超低溫冰箱中長期保存。切取過程按無菌操作進行，取不同患者標本時應更換刀片及器械。此外，分別取一小塊新鮮肝癌組織和癌旁組織(約黃豆大小 )，放入滅菌滅酶的EP管中用于標本入庫前的質量檢測。

1.5.2 石蠟組織標本收集、處理及保存 選擇離體后病肝組織中包含腫瘤及癌旁組織的標本進行切取，或者非腫瘤的病肝(良性肝病合并肝硬化)組織進行切取和固定，24 h后制備成石蠟標本塊。石蠟塊存放于病理標本柜中常溫保存。

1.5.3 血液標本的收集、處理及保存

1.5.3.1 血液標本的收集 血液標本的收集在病房進行，嚴防標本被異物污染。由責任醫師負責準備貼有醫院標簽及信息的血液采集管，并安排護士采集血液標本。采血在早晨患者進食前進行。采集方式為外周靜脈穿刺取血。采集每名患者及健康供肝者術前和術后1 周的血液標本15 ml，其中非抗凝血5 ml、抗凝血10 ml。責任醫師負責將采集的血液標本交至標本庫技術員，技術員于采血后3 h內完成血液標本的分離和保存。標本處理結束后，由技術員填寫血液標本登記表，并注明分離日期、時間、患者信息、標本信息，以及存放方式和具體位置。

1.5.3.2 血液標本的分離及保存 提取血漿及血清方法參照文獻[3]。將提取的血清和血漿分裝到0.5 ml離心管內，每管約200 μl。低溫冷凍保存(-80 ℃冰箱)，登記存檔。

提取血液DNA按照試劑盒說明書步驟操作，采用紫外分光光度儀(UVmini-1240)定量。將所有DNA分裝及標記編號后，置于-80 ℃保存。

1.6 標本信息化管理 管理人員嚴格按照標本入庫、出庫及保存規定進行規范化管理。自行設計并開發信息管理系統應用于肝癌肝移植標本庫的管理，系統軟件為Windows XP + Microsoft sqlserver2000 +IIS。系統功能錄入內容主要有患者信息、供體信息、標本信息、標本使用管理與使用置記、標本質量控制等。

2 結 果

2.1 標本收集 肝癌肝移植標本庫現保存有完整臨床資料的肝移植供、受者501例肝癌及良性肝病(研究對照)組織及血液標本。其中肝癌標本203例，良性肝病標本214例，健康供肝者84例。肝癌組織標本包括腫瘤組織、癌旁組織、遠端正常組織。目前保存了包括肝癌組織、癌旁組織及遠端非癌組織標本共計1773份，良性肝病肝硬化組織1320份，正常供肝組織84份。術前共收集肝移植受者血清和血漿均為398份，術后共收集受者血清和血漿分別為181份和179份；術前/術后血液DNA收集分別為356份和162份；術前/術后血液淋巴細胞收集分別為239份和113份。術前收集健康供者血清和血漿均為71份，術前/術后血液DNA收集分別為69份和52份。所收集對象的年齡為2～75歲，平均(47.2±12.1)歲；男437例(占87.2%)，女64例(占12.8%)。

2.2 標本質量監測

2.2.1 取材部位的準確性 筆者抽取45例已收集的新鮮凍存肝癌標本進行HE染色，其中42例包含的腫瘤組織面積≥80%,標本取材的準確率達90%以上；包含的腫瘤組織面積<80%的3例中有2例見腫瘤壞死組織(胞核消失)，考慮可能為術前抗腫瘤局部治療(肝動脈化療栓塞及射頻消融術)導致部分腫瘤組織壞死，1例為小肝癌，考慮為標本剩余量不足所致。

2.2.2 標本DNA、RNA的提取和鑒定 筆者對收集的凍存組織提取RNA，經紫外分光光度計分析A260/A280 均在1.6～1.8，對總RNA 進行瓊脂糖凝膠電泳，發現標本的完整性較好，受檢45例凍存組織樣本的RNA均可見清晰的28S 及18S 條帶，表明有較好的RNA完整性(圖1)。此外，利用凝膠電泳實驗檢測樣本DNA的質量，結果顯示所有檢測的DNA完整性良好，無降解，電泳條帶清晰(圖2)，能夠滿足科研實驗的要求。以上結果表明本試驗中凍存組織標本的取材、處理及保存操作方法及程序可確保標本質量合格。

筆者對采集的外周血液提取DNA和RNA的監測結果顯示標本的合格率分別為94%和91%，達到科研實驗的要求。少數標本DNA和RNA含量較少考慮可能與肝癌患者外周血中白細胞較低有關。

2.3 肝癌肝移植標本信息化管理系統的建立 制作了適合標準化生物標本庫要求且規范化的醫用資料計算機管理系統, 建立起包括腫瘤組織標本數據庫、血液標本數據庫、臨床信息數據庫、隨訪資料數據庫在內的肝癌肝移植臨床標本數據庫系統，完成了標本庫信息數據管理軟件的開發工作。

圖1 所收集肝癌凍存組織提取的RNA電泳圖

圖2 所收集肝癌凍存組織提取的DNA電泳圖

3 討 論

筆者自2009年8月起收集了501例肝癌及良性肝病(作為研究對照)肝移植供、受者的組織標本和血液標本，建立了科研型肝癌肝移植臨床標本庫。患者在簽署知情同意書后,經過專職人員收集移植患者的血液標本和手術摘除病肝組織標本，納入標本收集數據庫系統。血液標本的采集與保存由專職技術人員在相同條件下采集、保存，以避免人為偏差。此外，我所建立了肝移植患者術后隨訪門診及隨訪信息網站，因此具備較完整的患者術后長期隨訪信息數據，為肝癌肝移植術后復發、轉移的診斷及防治領域研究提供了可靠、準確的資源平臺。

標本質量控制是建立規范化標本庫的關鍵[3-5]。筆者建立的科研型肝癌肝移植標本庫質量控制體系包括完整的硬件設施、規范的操作流程、科學的信息管理系統、準確的臨床病理資料、隨訪系統及專業的技術人員。完整的硬件設施要求具備-80 ℃以下的低溫冰箱或液氮保存裝置、嚴格的溫控設備和監控設備，防止斷電及其他電力故障，避免標本反復凍融。標本的收集嚴格按照腫瘤組織標本的相關要求和流程進行規范操作，包括取材部位的準確性，組織離體后30 min內將組織置入液氮速凍或-80 ℃深低溫冷凍保存等。組織標本的離體時間對于標本的保存質量至關重要。多數學者推薦標本應在切除后30 min內取材并保存[6,7]，以避免基因組DNA～RNA和蛋白的降解。筆者對庫存標本進行隨機抽樣，進行DNA～RNA提取鑒定，證實利用本實驗中制定的規范化標準化程序，有利于建立高質量的的肝癌肝移植標本庫。標本規范的采集和保存是樣本質量符合科學研究的重要條件。為了保證標本庫中存放的標本的質量，需要定期抽查組織進行實驗，檢測標本是否發生降解等質量問題，這是保障標本庫質量的重要手段。

本標本庫均由指定的病理技術員專人進行標本采集、管理與錄入，以保證標本取材的準確性。筆者對收集的組織標本進行抽樣檢測，標本取材的準確率達90%以上。對于大肝癌或巨大肝癌組織，由于可能存在腫瘤中央組織缺血壞死，故選擇腫瘤邊緣取材；對于小肝癌及微小肝癌，存在留取病理科送檢標本后腫瘤剩余量較少，不夠取材新鮮標本和石蠟標本。這種情況下，筆者首先確保石蠟標本的收集。因為石蠟標本保存時間長，操作簡便、利用率高。專業的技術和管理人員是標本庫質量控制體系關鍵所在[8]。

筆者制作了規范化的標本信息資料計算機管理系統,通過對501例肝癌及良性肝病肝移植供、受者標本信息的錄入和初步分析，檢驗了該系統擁有完善的數據錄入、查詢、分析界面，可以提供簡單便捷的管理系統，有效提高標本信息管理的準確性和可操作性。此外，由于患者肝移植術后需長期終生隨訪，本實驗中利用我院移植門診錄入的隨訪信息系統，收錄了患者肝移植術后的隨訪信息，建立了全面、完善的肝癌肝移植標本信息化管理系統。

高質量的臨床標本是進行科學研究的先決條件。建立規范化的肝癌肝移植標本庫可為肝移植領域研究提供珍貴的臨床樣本資源，不僅可以充分保護、合理利用肝癌肝移植標本資源，還可確保科研工作的正確性和科學性，對促進肝癌肝移植研究的發展具有十分重要的醫學意義。

[1] Vitale A，Volk M，Cillo U. Transplant benefit for patients with hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2013,19(48):9183-9188.

[2] Belghiti J，Fuks D. Liver resection and transplantation in hepatocellular carcinoma[J]. Liver Cancer，2012,1(2): 71-82.

[3] Hughes S，Barnes R O，Watson P H.Biospecimen use in cancer research over two decades[J].Biopres Biobank，2010，8(2)：89-97.

[4] 高 丹，喻晶晶，梁慧芳，等.肝癌生物樣本庫的建立和質量鑒定[J].實用醫學雜志，2013， 29(11)：1734-1735.

[5] Moore H M，Kelly A，Jewell S D，etal.Biospecimen Reporting for Improved Study Quality(BRISQ)[J].J Proteome Res，2011，10(8)：3429-3438.

[6] Mager S R, Oomen M H, Morente M M，etal.Standard operating procedure for the collection of fresh frozen tissue samples[J].Eur J Cancer,2007，43(5): 828-834.

[7] 和 鋼，孟慶勇，張 順，等.腫瘤組織庫存標本的質量控制[J].浙江中西醫結合雜志,2009，19(7):412-414.

[8] 孫榮國，賈曉蓉.對我國臨床標本庫建設的建議[J].衛生軟科學，2012，26(9)：772-773.

(2014-07-05收稿 2014-07-20修回)

(責任編輯 岳建華)

To establish quality control system of research-based clinical transplantation specimens bank for hepatocellular carcinoma

WANG Letian1, ZHANG Qing1, HAO Yuwen2, CHEN Hong1, CHEN Xinguo1, and SHEN Zhongyang1.

1.Institute of Organ Transplantation, 2.Computer Management Center， General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China

Objective To study the quality control system for establishment of liver transplantation(LT)biological specimen (bio-specimens) bank for hepatocellular carcinoma(HCC), development of a standardized HCC for LT bio-specimens collection, processing and preservation operation process. To establish at sound and comprehensive information management system to conduct a systematic management of clinical information of collected specimens. Methods Referring to standardized procedures to establish bio-specimens banks, the operational processes system in HCC for LT sample collection and quality control system were developed and standardized. Liver tissue and blood samples of HCC patients for LT were collected, While liver tissue and blood samples of benign liver disease in liver transplant recipients and of healthy donor were collected as a research control. A systematic management of clinical information of specimens collected was conducted. Results From the development of standardized sample collection procedures, in August 2009, and from 501 recipients and donors for LT, specimens of tissues and blood samples were collected. The total number of HCC specimens including tumor tissues, adjacent tissues and remote non-cancerous tissue specimens was 1773. And 45 were randomly selected for DNA and RNA testing; the results proved that the accuracy rate of pathological sampling was above than 90% and these collected specimens had a high quality. HCC specimen information data computer management was established and improved. Conclusions The initial establishment of standardized research-based clinical transplantation specimens bank for HCC is helpful to improving the efficiency of sample collection and quality. It provides a standardized samples resources platform for scientific research in the field.

hepatocellular carcinoma；liver transplantation；bio-specimens bank；standardized collection；information management

國家自然科學基金項目(81372595)；首都臨床特色應用研究項目(Z121107001012168)；武警總醫院院內資助項目二類(WZ2010027)

王樂天，碩士，主管技師，E-mail: wanglt527@126.com

100039北京，武警總醫院：1.肝移植研究所, 2計算機管理中心

張 慶,E-mail: zqy6920@sina.com

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