P63蛋白在肺癌中表達的定量分析及其與癌細胞凋亡的關系

王 璐，申 洪

P63蛋白在肺癌中表達的定量分析及其與癌細胞凋亡的關系

王 璐1，申 洪2

目的 對P63蛋白在正常肺臟及肺癌組織中的分布進行定量分析，判斷其表達與細胞凋亡的關系。方法 收集肺癌組織標本及腫物周圍正常肺組織，制備組織芯片。以免疫組織化學方法鑒定P63表達并進行量化分析；以脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(TUNEL)法判斷細胞凋亡并進行量化分析；最終將結果量化為陽性單位(PU)進行分析。結果 肺鱗癌細胞核P63的PU值大于正常肺支氣管上皮、肺腺癌、大細胞癌、小細胞癌細胞核P63的PU值(P<0.01)；肺腺癌、大細胞癌、小細胞癌的PU值小于正常肺支氣管上皮細胞核P63的PU值(P<0.01)；正常肺組織中P63的表達與細胞凋亡之間無相關關系(r=0.1619，P>0.05)；肺癌組織中P63的表達與細胞凋亡呈正相關(r=0.3333，P<0.001)。結論 正常肺組織中P63的表達量和細胞凋亡是兩個獨立存在的事件；而肺癌組織中P63的表達與細胞凋亡呈正相關。

P63；肺癌；凋亡；定量分析

P63是近幾年發現的P53家族新成員，它編碼結構和功能不同的異構體。其中，全長表達的P63蛋白能激活P53相關靶基因，阻遏細胞周期和誘導細胞凋亡。而N端被截短的P63蛋白卻拮抗P53和全長表達的P63的功能。P63基因在腫瘤發生、細胞凋亡和組織發育的研究中備受關注[1-3]。以往研究中對P63在肺癌中的表達研究僅為定性觀察，揭示了其在不同類型肺癌中的表達情況，但其表達的量化特點及基于量化改變的變化規律尚未見報道[4-6]。本研究利用組織芯片技術和圖像分析技術定量測試P63在肺癌中的表達情況，從量化角度揭示P63在正常肺及不同類型肺癌中的表達特點, 探索其變化規律，在此基礎上利用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(Tdt-mediated dUTP Nick-End labeling,TUNEL)技術對肺癌組織芯片進行原位細胞凋亡檢測并作相應定量測試分析，從量化角度探討P63與細胞凋亡在肺癌發生、發展過程中的作用及兩者之間的相關關系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集南方醫院病理科2003-01至2005-12肺癌組織活檢標本100例，另取腫物周圍正常肺組織8例，患者術前未接受任何輔助治療。分組如下:正常肺組8例；肺癌組100例，男57例,女43例；年齡21～76歲,平均57歲。按世界衛生組織肺癌組織學分類法(1999年)將肺癌組進一步分為腺癌組(35例)、鱗癌組(42例)、大細胞癌組(12例)和小細胞癌組(11例)。TNM分期：Ⅰ期59例，Ⅱ～Ⅳ期41例。標本均新鮮取材，中性甲醛溶液固定,石蠟包埋。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片制作 制作1個15×28陣列的含432個組織芯的蠟塊，組織微陣列制作儀為美國Beecher Instruments公司MTA-1型。

1.2.2 P63的免疫組化檢測及定量分析 采用標準SP法進行免疫組化染色。鼠抗人P63單克隆抗體(即用型)、SP試劑盒和DAB試劑盒均購自福州邁新公司，PBS取代一抗做空白對照，用肺鱗癌組織做陽性對照，在確定無假陽性和假陰性的前提下以細胞核成棕黃或棕褐色為陽性。

1.2.3 原位凋亡細胞檢測 應用TUNEL技術檢測正常肺支氣管上皮及肺癌細胞凋亡，原位凋亡細胞檢測試劑盒購自美國Boehringer公司。光鏡下觀察，細胞核中有棕褐色顆粒者為陽性細胞即凋亡細胞。

1.2.4 P63及凋亡細胞定量分析 應用美國徠卡公司Leica Q500MC圖像分析系統，在40倍物鏡下，每個樣本隨機選取20個視野，每例樣本共測試200個陽性細胞，用交互式測量方法測量每個陽性細胞胞核的灰度值Gα，同時在相應的20個視野中測試背景灰度并取其平均值Gβ，按公式PU=[(Gα-Gβ)/Gmax]×100計算每個陽性細胞胞核的陽性單位PU值。其中Gmax為設定的灰度最高級，取每個樣本中200個陽性細胞PU值的均值作為此樣本的陽性單位PU值。

1.3 統計學處理 用SPSS13.0統計分析軟件包進行數據處理，采用方差分析及直線相關對數據進行統計分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 P63在正常肺組織及肺癌組織中的表達 正常肺支氣管上皮細胞核P63的PU值小于肺鱗癌細胞核P63的PU值(P<0.01)；肺腺癌、大細胞癌、小細胞癌細胞核P63的PU值均小于正常肺支氣管上皮細胞核P63的PU值(P<0.01)；肺大細胞癌細胞核P63的PU值與肺腺癌細胞核P63的PU值相比差異無統計學意義(P=0.747)；肺小細胞癌細胞核P63的PU值均小于肺腺癌、鱗癌、大細胞癌細胞核P63的PU值，差異有統計學意義(P<0.01，表1)。

2.2 細胞凋亡在正常肺組織及肺癌組織中的表達 細胞凋亡在正常肺組織及肺癌組織中的表達程度不同,差異有統計學意義(H=51.981，P<0.01)。正常肺上皮凋亡細胞胞核的PU值均大于肺腺癌、鱗癌、大細胞癌、小細胞癌凋亡細胞胞核凋亡的PU值(P<0.01)；肺大細胞癌凋亡細胞胞核的PU值均小于肺腺癌、鱗癌、小細胞癌凋亡細胞胞核的PU值(P<0.01)；肺小細胞癌凋亡細胞胞核的PU值均小于肺鱗癌、腺癌凋亡細胞胞核的PU值，差異有統計學意義(P<0.01)。肺鱗癌與肺腺癌凋亡細胞胞核的PU值之間比較，差異無統計學意義(表1)。

表1 正常肺組織與肺癌中P63PU值 與細胞凋亡PU值情況 ±s)

2.3 P63表達與細胞凋亡之間的相關關系 正常肺組織中P63的表達與細胞凋亡之間無相關關系(r=0.1619，P>0.05)；肺癌組織中P63的表達與細胞凋亡之間呈正相關關系(r=0.3333，P<0.001)。

3 討 論

P63對人類生長發育的調控可能通過與P53和P73的相互配合而起重要作用。正常生理情況下，P63蛋白在人類組織中廣泛存在,其異構體的分布各不相同，且呈廣泛而有選擇性地表達,如肺、皮膚、骨髂、肌肉、乳腺、胸腺、淋巴細胞、神經組織、消化系統和泌尿生殖系統等,尤其在增生的上皮細胞內多見[7]。Glickman等[8]發現,在食管鱗狀細胞中,P63 的上調可能對鱗癌的形成起重要作用。Massion等[9]用熒光原位雜交及免疫組化組織微陣列方法檢測了217例非小細胞肺癌中的P63表達,并對其中24例進行了RT-PCR檢測和Western Blotting 分析,以及對41例尚未發生浸潤的鱗狀上皮病變進行P63基因及蛋白檢測,發現88%的鱗狀細胞癌、42%的大細胞肺癌及11%的肺腺癌中出現P63基因擴增,且主要為ΔNp63α; Western Blotting表明ΔNp63α主要在正常支氣管和鱗狀細胞癌中表達，與細胞增殖密切相關。國內很多實驗室也開展了P63的相關研究，但多數只是定性，缺少對P63表達的定量分析[10-12]。傳統的定性分析方法具有簡單易行，結果判定重復性良好等優點，不足之處主要在于結果受諸多主觀因素干擾，易致誤差。定量分析技術對結果的判定更客觀、精確，人為因素干擾少，可重復性好，但對切片質量要求更高，陽性定位要準確，對非特異性背景染色要有很好的控制[13-15]。因此，定量分析技術可作為形態學定性分析的有益補充，尤其在腫瘤病理學診斷和預后的研究中可能發揮更大的作用。

本研究應用圖像分析系統，對正常肺組織和肺癌組織中P63陽性的細胞表達強度進行定量測試。結果表明，肺鱗癌細胞胞核P63的PU值大于肺腺癌、大細胞癌、小細胞癌及正常肺上皮細胞胞核P63的PU值，肺小細胞癌細胞胞核P63的PU值均小于其他各組，差異均有統計學意義。肺腺癌與大細胞癌P63的PU值之間無統計學差異。根據P63在肺鱗癌細胞中表達強度最高，在正常肺支氣管上皮基底細胞中的表達相對較弱，在肺腺癌、大細胞癌及小細胞癌中的表達強度較低的這一結果，筆者推測P63過表達與肺鱗狀細胞癌形成有密切關系，對于鱗癌的分型有一定的標志作用。

細胞凋亡是由于體內外某些因素觸發細胞內預存的死亡程序而導致的細胞主動性死亡方式[16]，因而又稱程序性細胞死亡。本研究通過相關性檢驗觀察肺癌中P63的表達與細胞凋亡之間的相關關系，發現肺組織中P63的表達與細胞凋亡之間不存在明顯的相關關系，提示P63的表達量和細胞凋亡是兩個獨立存在的事件。但是肺癌組織中P63的表達與細胞凋亡之間呈正相關關系，提示肺癌中P63表達水平與細胞凋亡具有相關性。肺癌細胞的凋亡和P63之間究竟通過何種機制發生關聯，尚需要進一步研究和探討。

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(2014-07-05收稿 2014-07-20修回)

(責任編輯 尤偉杰)

Quantitative analysis of p63 expression in lung cancers and its relationship with cancer cellular apoptosis

WANG Lu1and SHEN Hong2.

1. Outpatinet Department of Fuxing Road No.7, The First Affiliated Hospital of PLA General Hospital, Beijing 100869, China; 2. Department of Pathology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China

Objective To analyze the expression of protein p63 in normal lung and lung cancers quantitatively and judge its relationship with cellular apoptosis. Methods Lung cancer and normal lung tissues were collected and tissue arrays were prepared. The p63 expression was determined by immunohistochemistry and analyzed quantitatively. The cellular apoptosis was analyzed quantitatively by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL). The final qualified results (positive unit, PU) were analyzed statistically. Results The PU values of the intensity of p63 protein expression in normal lung tissue, adenocarcinoma, large cell carcinoma and small cell carcinoma were all lower than that in squamous carcinoma (P<0.01); The PU value of normal lung tissue was higher than those in adenocarcinoma, large cell carcinoma and small cell carcinoma (P<0.01); while there was a positive correlation between P63 protein expression and apoptosis in all kinds of lung cancer (P<0.01). Conclusions The extents of protein p63 expression are distinct on the normal lung and lung carcinoma tissues. The p63 expression and cellular apoptosis on the normal lung tissues are separated. However, p63 expression and cellular apoptosis on the lung malignant tissues are positively correlated.

p63；lung cancer；apoptosis；quantitative analysis

王 璐，碩士，醫師，E-mail:luwang6@126.com

1.100869北京，解放軍總醫院第一附屬醫院復興路7號門診部；2.510515廣州，南方醫科大學病理學系

申 洪，E-mail:shenhong2010168@163.com

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