新型食品添加劑LfcinB對腫瘤細胞生長的抑制作用

韓兆蓮，許曉曦

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

新型食品添加劑LfcinB對腫瘤細胞生長的抑制作用

韓兆蓮，許曉曦*

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

研究了LfcinB作為免疫強化劑以及營養(yǎng)強化劑對腫瘤細胞的抑制作用。主要應用CCK-8法檢測LfcinB對人T淋巴細胞白血病細胞（Jurkat細胞）活力的影響，應用雙標記流式細胞術分析LfcinB抑制Jurkat細胞生長的作用方式。研究結(jié)果證實，LfcinB對Jurkat細胞增殖的影響與LfcinB的作用時間和濃度呈正相關，而且LfcinB主要時通過誘導Jurkat細胞發(fā)生早期凋亡來抑制其增殖，并且其誘導Jurkat細胞早期凋亡的最佳濃度和時間分別為200μg/mL和48 h。

牛乳鐵蛋白素；Jurkat細胞；細胞凋亡

牛乳鐵蛋白素（LfcinB）是牛乳中乳鐵蛋白在酸性環(huán)境下經(jīng)胃蛋白酶作用N端釋放的一小段具有廣譜抗菌作用的生物活性肽。乳鐵蛋白素作為食品保存劑、抗氧化劑、營養(yǎng)強化劑、免疫強化劑、免疫調(diào)節(jié)劑等在食品領域得到廣泛的應用[1]。LfcinB不含稀有氨基酸和外源化學成分，是健康安全的天然物質(zhì)。LfcinB作為食品添加劑可調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)活性，增強對疾病的抵抗力[2]；提高產(chǎn)品乳化性能，促進脂肪消化吸收[3]；具有廣譜的抗菌性和抗脂質(zhì)氧化的作用[4-5]，故可用作防霉劑和抗氧化劑。近期研究，LfcinB對腫瘤細胞也具有一定的抑制作用[6-12]。本實驗深入探討了LfcinB抑制腫瘤細胞生長的作用機理，為LfcinB在食品中，特別是保健食品中作為營養(yǎng)強化劑、免疫強化劑、免疫調(diào)節(jié)劑等的應用提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Jurkat，Clone E6-1人T淋巴細胞白血病細胞（細胞編號TIB-152）：美國菌種保藏中心；LfcinB（氨基酸序列FKCRRWQWRM KKLGA PSITCVRRAF）：上海楚肽生物技術公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

Jurkat細胞培養(yǎng)在含有10%熱滅活胎牛血清的RMPI1640完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37℃，CO2濃度為5%，隔天換液，以保持細胞最佳生長狀態(tài)，細胞在進行實驗前均采用血清饑餓法處理24 h。

1.3 CCK-8法檢測LfcinB對Jurkat細胞增值抑制率的影響

1.3.1 CCK-8法

將藥物刺激后的細胞移入96孔細胞培養(yǎng)板中，按照試劑盒操作說明每孔添加適量的CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm處檢測各孔的吸光度值，并計算增殖抑制率。

1.3.2 LfcinB的濃度對Jurkat細胞增值抑制率的影響

Jurkat細胞分別在濃度為0、50、100、200、400μg/mL的LfcinB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，利用CCK-8法測定增值抑制率，每組實驗平行4次。

1.3.3 LfcinB的作用時間對Jurkat細胞增值抑制率的影響

Jurkat細胞在濃度為200μg/mL的LfcinB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24、48、72 h后，利用CCK-8法測定增值抑制率，每組實驗平行4次。

1.4 Annexin-FITC/PI雙標記流式細胞術檢測細胞凋亡

1.4.1 Annexin-FITC/PI雙標記流式細胞術

不同分組的LfcinB作用Jurkat細胞后，加入195μL Annexin-FITC結(jié)合液和5μL Annexin-FITC染色液，室溫避光孵育45min，然后離心收集細胞并加入190μL Annexin-FITC結(jié)合液和10μLPI染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，每個EP管最終的體積為500μL，上機前用200目篩網(wǎng)進行過濾，隨即進行流式細胞儀檢測。

1.4.2 LfcinB的濃度對Jurkat細胞早期凋亡的影響

Jurkat細胞分別在濃度為0、50、100、200、400μg/mL的LfcinB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，按照上述方法處理，利用流式細胞儀檢測Jurkat細胞的早期凋亡率。

1.4.3 LfcinB的作用時間對Jurkat細胞早期凋亡的影響

Jurkat細胞在濃度為200μg/mL的LfcinB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24、48、72 h后，按照上述方法處理，利用流式細胞儀檢測Jurkat細胞的早期凋亡率。

1.5 統(tǒng)計學處理

應用SPSS17.0軟件進行多實驗組均數(shù)與對照組均數(shù)比較的ANOVA中的Donnett-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 LfcinB的濃度對Jurkat細胞增值抑制率的影響

不同濃度的LfcinB對Jurkat細胞增殖的影響不同，結(jié)果見圖1。

從圖1中可以得出，Jurkat細胞的增值抑制率是隨著LfcinB濃度的增加而增加，即Jurkat細胞的活性隨著LfcinB濃度的增加而降低。結(jié)果顯示，濃度為200μg/mL和400μg/mL的LfcinB對Jurkat細胞的增殖抑制率較高，然而這兩個濃度對細胞產(chǎn)生的增值抑制率差距不大，從節(jié)約原料的角度出發(fā)，選擇濃度為200μg/mL作為LfcinB的最佳抑制濃度。

圖1 不同濃度的LfcinB對Jurkat細胞增殖的影響Fig.1 Effectsof different LfcinB concentration on Jurkat cells

2.2 LfcinB的作用時間對Jurkat細胞增值抑制率的影響

圖2為LfcinB作用時間不同的Jurkat細胞增值抑制率。

圖2 LfcinB的作用時間對Jurkat細胞增殖的影響Fig.2 Effectsof different LfcinB action timeon Jurkat cells

由圖2可知，隨著作用時間的增加，LfcinB對Jurkat細胞的增值抑制率有所增加，但增加幅度不大。即LfcinB的作用時間對增值抑制率的影響不大。

2.3 不同濃度的LfcinB對Jurkat細胞早期凋亡率的影響

圖3為不同濃度的LfcinB作用Jurkat細胞24 h后早期凋亡率的結(jié)果。

由圖3可知，在同一作用時間內(nèi)，Jurkat細胞的早期凋亡率隨著LfcinB濃度的增大而增加，但是200μg/mL和400μg/mL組Jurkat細胞的早期凋亡率差異不顯著。

2.4 LfcinB的作用時間對Jurkat細胞早期凋亡率的影響

圖4是濃度為200μg/mL的LfcinB作用Jurkat細胞不同時間后早期凋亡率的結(jié)果。

由圖4可知，對于同一作用濃度，不同作用時間的LfcinB來說，72 h時Jurkat細胞的早期凋亡率（Q4）較前兩個時間比較，有所降低，此結(jié)果表明，LfcinB作用誘導Jurkat細胞早期凋亡的最佳作用時間為48 h，而晚期凋亡或壞死細胞（Q2）的比例卻有所增加。

圖3 不同濃度的LfcinB對Jurkat細胞早期凋亡的影響Fig.3 Effectsof different LfcinB concentration on early apop tosisof Jurkat cells

圖4 LfcinB的作用時間對Jurkat細胞早期凋亡的影響Fig.4 Effectsof different LfcinB action tim eon early apoptosisof Jurkat cells

3 討論

LfcinB對膀胱癌、肺癌、食道癌及腫瘤轉(zhuǎn)移的預防與抑制作用在1999年被Ushida所證明[13]，但作用機制尚未完全證實。本實驗利用CCK-8法和雙標記流式細胞術分析得出LfcinB是通過促進Jurkat細胞發(fā)生早期凋亡來抑制Jurkat細胞生長達到抗腫瘤作用，對LfcinB抗腫瘤機制進行了初步探究，此結(jié)果為LfcinB作為免疫強化劑以及營養(yǎng)強化劑對腫瘤細胞的抑制作用的應用提供了理論依據(jù)。

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Inbibitional Effects of LfcinB as One New Food Additives on Cell Grow th of Cancer

HAN Zhao-lian，XUXiao-xi*

（College Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China）

Inhibition ofcancer cells from LfcinBas immune-enhancerand nutrientsupplementswas researched. Thisexperimentmeasured thevitalityof Jurkatcellsby CCK-8 and analysed themodeofaction from LfcinBeffect to human acute T lymphocyte leukemia cells（Jurkatcells）by doublemarker flow cytometry.According to the results，the effects of LfcinB to Jurkat cells on proliferation inhibition were positively related to the action concentration and time.And the proliferation inhibition of Jurkatcellsby LfcinBwasmainly induced by the early apoptosisratio，and thebestconcentrationand timetoinduce Jurkatcellsearlyapoptosiswas200μg/mLand48h.

Lfcin B；Jurkatcell；apoptosis

2013-12-12

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.005

韓兆蓮（1986—），女（滿），碩士研究生，主要研究方向：乳品營養(yǎng)與安全。

*通信作者