葵花籽仁中綠原酸的提取工藝

李延輝，塔長青，劉超，鄭鳳榮

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林吉林132101）

葵花籽仁中綠原酸的提取工藝

李延輝，塔長青，劉超，鄭鳳榮

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林吉林132101）

研究從葵花籽仁中提取綠原酸的最佳工藝條件。比較乙醇浸提法、微波提取法、超聲波法的提取率，確定提取綠原酸的最佳方法為超聲波法。研究乙醇濃度（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、超聲波功率（D）、料液比（E）對葵花籽綠原酸得率的影響，通過單因素及正交試驗，結(jié)果顯示，各因素對提取效果影響的順序主次為乙醇濃度＞超聲波功率＞提取溫度＞提取時間。最佳提取工藝條件為：乙醇濃度75%，提取溫度40℃，提取時間30min，超聲波功率300W。此工藝條件下綠原酸提取率為2.43%。

葵花籽仁；綠原酸；提取工藝；超聲波

我國葵花籽在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有較重的分量，年總產(chǎn)量位于世界第六[1]?？ㄗ炎鳛橄蛉湛墓麑?shí)，其多酚類物質(zhì)成分中主要是綠原酸，實(shí)質(zhì)是一種縮酚酸[2]。綠原酸在醫(yī)藥方面被廣泛研究與應(yīng)用具有抗菌、抗病毒、降脂、清除自由基等作用[3]。在食品方面綠原酸還可以被用作食品的添加劑等，如果將綠原酸應(yīng)用于果蔬保鮮中[4]。綠原酸極易被氧化近而形成鄰醌，不僅影響到蛋白產(chǎn)品的感官質(zhì)量，而且大大降低了蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值和功效[5]。因此，將葵花籽粕中的綠原酸提取出來，不僅能避免由于綠原酸的存在引起的葵花籽分離蛋白變黑引起的色澤不穩(wěn)定現(xiàn)象，同時還能創(chuàng)造更高的經(jīng)濟(jì)效益，為葵花籽蛋白的進(jìn)一步利用創(chuàng)造了必要的條件，提升葵花籽及葵花籽粕的商業(yè)價值[6]。

目前提取綠原酸的方法很多，如水提醇沉法、微波提取、乙醇提取、酶法提取、超聲波提取等[7]。本文通過單因素及正交試驗，得到最佳的提取工藝，為葵花籽粕中提取綠原酸的工業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

葵花籽仁：市場購買（碾碎，除油干燥，備用）。

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)樣品（中國藥品生物制品檢定所，純度98.2%）。乙醇（分析純）、甲醇（分析純）、正己烷（化學(xué)純）、乙酸乙酯（分析純）等。

DHG-9420A型電熱恒溫古風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司；G8ON25YSL-501A型微波爐：佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司；SY-360型超聲波清洗器：上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司；UV-1700光柵紫外可見分光光度計“上海精宏科學(xué)儀器有限公司；LG-08A型兩裝高速中藥粉碎機(jī)：瑞安市百信藥機(jī)械廠；AL104型分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取劑的選擇

綠原酸屬于一種弱酸性化合物，易溶于水、乙醇、甲醇等極性溶劑的極性有機(jī)酸，不溶于苯、乙醚、氯仿等非極性溶劑[8]。本實(shí)驗選用乙醇作為提取劑。

1.2.2 工藝流程

乙醇浸提法：原料挑選→去殼→粉碎→除油→干燥→乙醇溶劑浸提兩次→合并浸提液→過濾→萃取純化→測吸光度值→計算綠原酸得率。

超聲波輔助提取法：原料挑選→去殼→粉碎→除油→干燥→超聲波輔助提取→過濾→萃取純化→測吸光度值→計算綠原酸得率。

微波輔助提取法：原料挑選→去殼→粉碎→除油→干燥→微波輔助提取→過濾→萃取純化→測吸光度值→計算綠原酸得率。

1.2.3 操作要點(diǎn)

1.2.3.1 原料的選擇及處理

選擇質(zhì)粒飽滿新鮮的葵花籽，機(jī)械去殼，用粉碎機(jī)充分粉碎，稱取粉碎的葵花籽粕300 g移入干凈大燒杯中，按1∶2（g/mL）的料液比加入正己烷溶液，浸泡2 h，將燒杯置于超聲波清洗器中，設(shè)定功率為400W，75℃下處理15min，過濾后傾出上清液，將沉淀物放入80℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，過40目篩[9]，備用。

1.2.3.2 乙醇溶劑浸提法

準(zhǔn)確稱取脫脂并烘干的葵花籽粕5.00 g，置于250mL錐形瓶中，調(diào)pH為4.5，在70℃恒溫水浴鍋中用75%的乙醇溶劑浸提兩次[10]，料液比為1∶15（g/mL）和1∶10（g/mL），每次浸提時間為40min，合并浸提液，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至30mL，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸乙酯與原料液的體積比為1.5∶1，再濃縮，濃縮液用相應(yīng)濃度的乙醇定容至50mL容量瓶中，稀釋10倍，在324 nm[11]處測吸光度，計算得率。

1.2.3.3 微波輔助提取法

準(zhǔn)確稱取脫脂并烘干的葵花籽粕5.00 g，置于250mL錐形瓶中，加入75%的乙醇溶劑100mL，置于微波爐內(nèi)，60℃在440W下提取7min[12]。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至30mL，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸乙酯與原料液的體積比為1.5∶1，再濃縮，濃縮液用相應(yīng)濃度的乙醇定容至50mL容量瓶中，稀釋10倍，在324 nm處測吸光度，計算得率。

1.2.3.4 超聲波輔助提取法

準(zhǔn)確稱取脫脂并烘干的葵花籽粕5.00 g，置于250mL錐形瓶中，加入75%的乙醇溶劑100mL，置于超聲波清洗器內(nèi)，超聲波功率為300W，30℃超聲提取30min。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至30mL，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸乙酯與原料液的體積比為1.5∶1，再濃縮，濃縮液用相應(yīng)濃度的乙醇定容至50mL容量瓶中，稀釋10倍，324 nm處測吸光度，計算得率。

1.2.4 綠原酸最大吸收波長的確定

將綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用UV-1700紫外分光光度計在220 nm～440 nm范圍內(nèi)掃描，測定其吸光度，確定綠原酸最大吸收波長。

1.2.5 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制[2]

以50%甲醇為空白對照，準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，用50%甲醇溶解并定容至50mL容量瓶，搖勻得0.2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確吸取1、2、3、4、5、6、7、8mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于8個10mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻得到不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。用紫外分光光度計在220 nm~440 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，選取綠原酸的最大吸收波長，在該波長處分別測定各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度（A）。以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度（C）為橫坐標(biāo)，其吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定綠原酸濃度-吸光度關(guān)系曲線回歸方程。

1.2.6 綠原酸得率計算[12]

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線綠原酸的濃度，（mg/mL）；N為稀釋倍數(shù)（10）；V為溶液體積（50mL）；W為葵花籽粕質(zhì)量，g。

1.2.7 3種提取方法結(jié)果的比較

3種提取方法結(jié)果的比較見表1。

表1 3種方法的綠原酸提取率Table1 Comparing of threeextractions

通過前期試驗比較，超聲波提取綠原酸的效果較好，在同質(zhì)量下提取率為2.16%，而且通過超聲作用可以減少實(shí)驗時間，故針對此方法進(jìn)行工藝優(yōu)化。

1.2.7 超聲波法提取綠原酸的工藝優(yōu)化

1.2.7.1 單因素試驗

分別選取乙醇濃度55%、65%、75%、85%、95%；提取溫度25、30、35、40、45℃；提取時間20、25、30、35、40min；超聲波功率為100、200、300、400、500W；料液比1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶28（g/mL）5個水平進(jìn)行單因素試驗，選出最佳因素和水平。

1.2.7.2 乙醇濃度對葵花籽綠原酸得率的影響

準(zhǔn)確稱取脫脂并烘干的葵花籽粉末2.5 g，按照1∶20（g/mL）的料液比加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液置于150mL錐形瓶中，超聲波功率為300W，35℃提取30 min，分離出提取液，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至30mL，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸乙酯與原料液的體積比為1.5∶1，再濃縮，濃縮液定容至50mL容量瓶中，稀釋，在324 nm處測吸光度，計算得率，確定乙醇的最佳提取濃度。

1.2.7.3 提取溫度對葵花籽綠原酸得率的影響

準(zhǔn)確稱取脫脂并烘干的葵花籽粉末2.5 g，按照1∶20（g/mL）的料液比加入75%的乙醇溶液置于150mL錐形瓶中，超聲波功率為300W，不同溫度下超聲波提取30min，分離出提取液，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至30mL，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸乙酯與原料液的體積比為1.5∶1，再濃縮，濃縮液定容至50mL容量瓶中，稀釋，在324 nm處測吸光度，計算得率，確定最佳提取溫度。

1.2.7.4 提取時間對葵花籽綠原酸得率的影響

準(zhǔn)確稱取脫脂并烘干的葵花籽粉末2.5 g，按照1∶20（g/mL）的料液比加入75%的乙醇溶液置于150mL錐形瓶中，超聲波功率為300W，35℃超聲波提取不同時間，分離出提取液，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至30mL，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸乙酯與原料液的體積比為1.5∶1，再濃縮，濃縮液定容至50mL容量瓶中，稀釋，在324 nm處測吸光度，計算得率，確定最佳提取時間。

1.2.7.5 超聲波功率對葵花籽綠原酸得率的影響

準(zhǔn)確稱取脫脂并烘干的葵花籽粉末2.5 g，按照1∶20（g/mL）的料液比加入75%的乙醇溶液置于150mL錐形瓶中，在不同的超聲波功率下，35℃超聲波提取30min，分離出提取液，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至30mL，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸乙酯與原料液的體積比為1.5∶1，再濃縮，濃縮液定容至50mL容量瓶中，稀釋，在324 nm處測吸光度，計算得率，確定最佳的超聲波功率。

1.2.7.6 料液比對葵花籽綠原酸得率的影響

準(zhǔn)確稱取脫脂并烘干的葵花籽粉末2.5 g，分別以1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶28（g/mL）的料液比加入75%的乙醇溶液置于150mL錐形瓶中，在300W，35℃超聲波提取30min，提取液用微孔膜過濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至30mL，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸乙酯與原料液的體積比為1.5∶1，再濃縮，濃縮液定容至50mL容量瓶中，稀釋，在324 nm處測吸光度，計算得率，確定最佳的料液比。

1.2.7.7 提取條件的優(yōu)化處理

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以綠原酸得率為指標(biāo)，選取乙醇濃度、提取溫度、提取時間、超聲波功率為考察因素，各取3個水平，設(shè)計正交試驗，每項試驗重復(fù)3次，對超聲波輔助提取葵花籽綠原酸工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸最大吸收波長的確定

將綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用UV-1700紫外分光光度計在220 nm～440 nm范圍內(nèi)掃描，測定其吸光度，確定綠原酸最大吸收波長，結(jié)果如圖1所示。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液的吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of Chlorogenic acid standard solution

從圖1可以看出，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收光譜在324 nm處出現(xiàn)最高峰，且吸光度達(dá)到最大值為0.662，所以選擇波長324 nm為綠原酸的檢測波長。

2.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

以50%甲醇為空白對照，準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，用50%甲醇溶解并定容至50mL容量瓶，搖勻得0.2mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確吸取1、2、3、4、5、6、7、8mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于8個10mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，得到不同質(zhì)量濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。用紫外分光光度計在220nm~440 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，選取綠原酸的最大吸收波長為324 nm，在324 nm波長處分別測定各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度（A）。以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度（C）為橫坐標(biāo)，其吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curveof Chlorogenic acid

從圖2可以確定綠原酸濃度-吸光度關(guān)系曲線回歸方程：A=3.573 7C+0.176 0，R2=0.999 8。結(jié)果表明，綠原酸在0.02mg/mL~0.160mg/mL濃度范圍內(nèi)，綠原酸濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3 單因素實(shí)驗結(jié)果與分析

2.3.1 乙醇濃度對葵花籽綠原酸得率的影響

不同濃度的乙醇溶液對綠原酸提取率結(jié)果如圖3所示。

圖3 乙醇濃度對綠原酸提取率的影響Fig.3 Chlorogenic acid yield effectof ethanolconcentration

從圖3可以看出，在55%至75%范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增加，乙醇溶解綠原酸的能力也增強(qiáng)，乙醇濃度達(dá)到75%時提取率最高，隨后提取率又呈下降趨勢。原因經(jīng)分析有兩點(diǎn)，一是由于長時間的超聲波熱效應(yīng)作用，乙醇濃度越高越容易揮發(fā)，使得高濃度的乙醇揮發(fā)較快而提取率下降；二是由于高濃度的乙醇容易使葵粕中蛋白質(zhì)變質(zhì)，進(jìn)而包埋住綠原酸使其提取率下降。因此，綜合以上因素考慮，選擇75%乙醇溶液為最佳提取劑。

2.3.2 提取溫度對葵花籽綠原酸得率的影響

不同溫度下對綠原酸提取率結(jié)果如圖4所示。

圖4 浸提溫度對綠原酸提取率的影響Fig.4 Chlorogenic acid yield effectof extraction temperature

通過分析提取溫度對葵花籽粕中綠原酸提取率的影響，從圖4可以看出，提取溫度在25℃～40℃范圍內(nèi)，綠原酸的提取率隨著溫度升高而增加，40℃時其提取率值達(dá)最高，當(dāng)溫度達(dá)到40℃以后，綠原酸的提取率隨著溫度升高而降低。其原因是綠原酸的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，高溫加熱易氧化分解。也可能是葵花籽粕中其他成分在高溫下溶解出來影響提取效果。因此提取溫度以40℃效果最好。

2.3.3 提取時間對葵花籽綠原酸得率的影響

提取時間對綠原酸提取率結(jié)果如圖5所示。

圖5 超聲波作用時間對綠原酸提取率的影響Fig.5 Ch lorogenic acid yield effectof extraction time

從圖5可以看出，超聲時間為30min時綠原酸的提取效果最好。超聲時間小于30min時，綠原酸提取率隨時間延長呈逐漸增大的趨勢。當(dāng)提取時間超過30min時，綠原酸提取率趨于穩(wěn)定。因此，綜合考慮，超聲輔助提取時間以30min為宜。

2.3.4 超聲波功率對葵花籽綠原酸得率的影響

不同的超聲波功率對綠原酸提取率結(jié)果如圖6所示。

圖6 超聲波功率對綠原酸提取率的影響Fig.6 Chlorogenic acid yield effectofultrasonic power

從圖6可以看出，隨著超聲功率的增大，綠原酸的提取率也隨增大，最大提取率達(dá)到了2.428%。這是因為超聲能夠產(chǎn)生空化作用，這種空化效應(yīng)對物料的細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破使得有效成分很容易滲出，從而提取率升高。超過300W后，綠原酸提取率明顯下降，這可能是因為高功率破壞了葵花籽粕中綠原酸的成分，所以超聲最佳提取功率為300W。

2.3.5 料液比對葵花籽綠原酸得率的影響

料液比對綠原酸提取率結(jié)果如圖7所示。

圖7 料液比對綠原酸提取率的影響Fig.7 Chlorogenic acid yield effectof ratio of liquid to solids

從圖7可以看出，料液比對綠原酸的提取效果趨于穩(wěn)定。當(dāng)料液比在1∶20（g/mL）時，葵花籽粕中綠原酸的提取率略占高峰。繼續(xù)增大料液比會增加成本，也增大了提取液的濃縮工作。出于節(jié)約溶劑、降低成本等因素考慮，料液比的選擇不宜太高。因此，通過以上考慮，選擇最佳的料液比為1∶20（g/mL）。

2.4 正交試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以綠原酸得率為指標(biāo)，選取乙醇濃度、提取時間、提取溫度以及超聲波功率為考察因素，設(shè)計L9（34）正交試驗，每項試驗重復(fù)3次，對超聲波輔助提取葵花籽綠原酸工藝進(jìn)行優(yōu)化，因素和水平選取見表1，正交試驗結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素水平表Talbe1 Design of factorsand levels in orthogonal test

表2 綠原酸提取工藝正交試驗結(jié)果分析表Talbe2 Analysisoforthogonal test for Chlorogenic acid extraction processing

由表2可以看出，影響綠原酸提取率的主次因素為乙醇濃度＞超聲波功率＞提取溫度＞提取時間，即A＞D＞B＞C，試驗的最佳提取工藝條件組合為A2B3C1D2，即在乙醇濃度為75%，提取溫度40℃，提取時間30min，超聲波功率300W的條件下綠原酸提取率為2.43%。此時，綠原酸的提取率達(dá)到最大值。

3 結(jié)論

1）將綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用UV-1700紫外分光光度計在220 nm～440 nm范圍內(nèi)掃描，確定綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收波長為324 nm。

2）通過單因素和正交試驗對超聲波輔助提取葵花籽粕中綠原酸工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，在料液比為1∶20（g/mL），乙醇濃度75%，提取溫度40℃，提取時間30min，超聲波功率300W條件下綠原酸提取率為2.43%，綠原酸提取率達(dá)到最大值。

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Extraction Processing of Chlorogenic Acid from Sunflower Seed Kernel

LIYan-hui，TAChang-qing，LIUChao，ZHENG Feng-rong

（Schoolof Food Technology，Jilin Agriculture Science and Technology College，Jilin 132101，Jilin，China）

In thisessay，the extraction processing ofChlorogenic Acid from sunflower seed kernelwas studied. By comparing three extractions，asethanolextraction，microwave extraction，ultrasonic extraction，the optimal was ultrasonic extraction with ethanol as extractant.And four factors，ethanol concentration，extraction time，extraction temperatureand ultrasonic power in thisprocessingwere studied.By single factor testsand orthogonal tests，theoptimalprocessingconditionswereas follows：the influenceorderof these factorsisethanol＞ultrasonic power＞the concentration of extraction temperature＞extraction time，and ethanol concentration was 75%，extraction temperature was 40℃，extraction time was 30 min，ultrasonic power was 300 W.Under these conditions，theproductyield could reached up to2.43%.

sunflower seed kernel；chlorogenic acid；extraction；ultrasonicwave

2014-05-16

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.012

吉林省教育廳“十二五”科技項目（吉教科合字[2012]第305號）

李延輝（1969—），男（漢），教授，碩士，主要從事食品加工與安全方面的研究與教學(xué)。