食用油脂中苯并（α）芘檢測方法比較與優化

宋長虹，唐生，佟馨，郝克非，尚剛，鄧斌

（1.中糧北海糧油工業（天津）有限公司，天津300454；2.中糧集團油脂部生產與質量安全部，北京100020）

食用油脂中苯并（α）芘檢測方法比較與優化

宋長虹1，唐生2，佟馨2，郝克非1，尚剛1，鄧斌1

（1.中糧北海糧油工業（天津）有限公司，天津300454；2.中糧集團油脂部生產與質量安全部，北京100020）

食用油中苯并（α）芘的檢測主要包括樣品的預處理和測定2個基本過程，由于植物油中苯并（α）芘含量極微，穩定性差，樣品基體復雜且存在潛在的多種干擾物，如大量甘油三酯和脂肪伴隨物，所以如何快速、準確地檢測出食品中的苯并（α）芘，就成為人們現階段研究的重點。以國家標準GB/T22509-2008《動植物油脂苯并（α）芘的測定反相高效液相色譜法》為基礎，對幾種樣品前處理方法及液相色譜條件進行優化，并對檢測結果進行對比。

食用油；苯并（α）芘；對比；檢測方法

苯并芘（Benzopyrene），苯與芘稠合而成的一類多環芳烴，通常認為苯并（α）芘是一種公認的致癌物質、斷裂劑、誘導有機體突變的物質和環境污染物。油料在加工過程中因接觸污染物、高溫炒制、高溫精煉加工都會受到B（α）P污染，從而引發B（α）P向食用油遷移。許多國家和組織對直接消費的植物油中B（α）P的含量有著嚴格的標準。歐盟規定食用油中B（α）P的最大限量為2μg/kg；國際食品法典委員會（CAC）規定食用油脂中B（α）P的最大限量為5μg/kg；我國GB 2716-2005《食用植物油衛生標準》規定最大限量為10μg/kg[1-3]。

食用油中苯并（α）芘的分析主要包括樣品的預處理和測定2個基本過程。由于植物油中苯并（α）芘含量極微，穩定性差，樣品基體復雜且存在潛在的多種干擾物，如大量甘油三酯和脂肪伴隨物，所以如何快速、準確地檢測出食品中的苯并（α）芘，就成為人們現階段研究的重點。目前，食用油中苯并（α）芘的檢測方法主要有薄層層析法、熒光分光光度法、高效液相色譜法和氣相色譜-質譜聯用。薄層層析法是傳統的分析B（α）P方法，但此法的缺點是操作步驟繁多，分析周期較長。熒光分光光度法樣品處理過程較為復雜，同時前處理一些熒光物質有本底干擾，與液相色譜相比，此方法操作過程復雜，分析時間長、準確度低。高效液相色譜方法簡便，安全性好，靈敏度高，線性范圍寬，精確度高，最小檢出限為0.1μg/kg。氣質聯用技術是鑒定中苯并（α）芘的最有效方法，此方法的分離效果及色譜重現性好，可用于復雜體系中痕量組分苯并（α）芘的定量測定，但對儀器要求比較高，成本較高，不利于推廣[4-6]。

以國家標準方法GB/T22509-2008《動植物油脂苯并（α）芘的測定反相高效液相色譜法》為基礎，旨在對高效液相色譜法測定食用油中苯并（α）芘含量的幾種樣品前處理方法及色譜條件進行研究及優化，并對檢測結果進行對比。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

高效液相色譜儀：戴安UltiMate3000，帶自動進樣器、紫外檢測器、熒光檢測器；旋轉蒸發儀（IKARv10）；VP50真空抽濾泵：北京萊伯泰克；H50循環水冷卻器：北京萊伯泰克；苯并芘SPE固定化萃取柱（22 g/60mL、500mg/6mL）；0.45μm微孔過濾膜（水系）、0.45μm微孔過濾膜（有機系）；微量移液器及配套吸頭10μL～100μL；天平：感量0.0001g；玻璃器皿：容量瓶（25mL）、帶塞比色管（10mL）、玻璃樣品瓶（1mL）、玻璃樣品瓶（2mL）、圓底燒瓶。

1.1.2 試劑

色譜級：正己烷或石油醚；乙腈；水；四氫呋喃；

分析純：丙酮；甲酸溶液；8%H3PO4-DMSO溶液；5%KOH溶液；異丙醇；苯并（α）芘標準品：100mg。

1.2 苯并（α）芘檢測方法

1.2.1 樣品前處理[7-11]

方法1：稱取混勻的油樣0.30 g與10mL玻璃管中，不超過0.31 g；向10mL玻璃比色管中加入約5mL的正己烷，蓋上塞子搖約5min，使油樣完全溶解；將溶解后的溶液倒入苯并芘SPE固定化萃取柱（22g/60mL）中，讓其緩慢流下不需加壓，液體流下之后往氧化鋁柱中加入正己烷加滿，濾完之后接著加滿，連續2次；水浴溫度65℃，轉速60 r/min，蒸發致平底燒瓶中剩余約0.5mL~1mL正己烷時停止蒸發；將平底燒瓶中的正己烷轉入玻璃離心管中，并用少量正己烷沖洗轉入其中，用高純氮氣將其吹干；往玻璃離心管中加入900μL乙腈，再加入100μL四氫呋喃混合液，用微量移液器將其混勻，并將其轉入樣品瓶中，等待進樣。

方法2：稱取混勻的油樣2.5 g于10mL玻璃管中，計重；向10mL玻璃比色管中加入5mL的四氫呋喃，并用乙腈定容至10mL，蓋上塞子搖約5min，使油樣完全溶解；將溶解后的溶液經0.45μm微孔過濾膜（有機系）過濾至2mL樣品瓶中，等待進樣。

方法3：稱取混勻的油樣0.2 g~0.4 g于10mL玻璃管中；向10mL玻璃比色管中加入約2mL的正己烷，蓋上塞子搖約5min，使油樣完全溶解；在苯并芘SPE固定化萃取柱（500mg/6mL）中依次加入5mL丙酮，2mL正己烷活化；將待凈化液加入苯并芘柱中（在柱中正己烷液面為2mm時上樣，此過程不要使柱干涸），流出液棄去；待上樣液完全流出后，用6mL的異丙醇/正己烷（體積比1∶4）溶液淋洗，淋洗液棄去，將小柱抽干；用6 mL丙酮解吸，收集解吸液；解吸液40℃氮氣吹干，加入900μL乙腈，再加入100μL四氫呋喃混合液，用微量移液器將其混勻，并將其轉入樣品瓶中，等待進樣。

方法4：稱取10 g樣品，用50mL正己烷分數次溶解，加入90%甲酸提取2次后（每次10mL），加入8% H3PO4-DMSO溶液40mL，振搖2min，靜置分層，上層正己烷液中加入40mLDMSO，棄去上層正己烷溶液，合并2次DMSO提取液，加入30mL正己烷反提取1次，棄去正己烷洗液。正己烷洗后的DMSO提取液中加入70mL 1∶1 HCl溶液，振搖2min，后用正己烷提取2次，每次40mL，振搖2min，棄去下層，合并2次正己烷提取液。后用30mL 5%KOH溶液洗1次，蒸餾水洗2次，每次40mL，棄去水層，后于旋轉蒸發儀中蒸干，乙腈定容至0.5mL待測。

1.2.2 標準曲線的繪制

苯并（α）芘標準貯備溶液：準確稱取10mg苯并（α）芘于100mL容量瓶中，用甲苯溶解，定容。此溶液約含苯并（α）芘100mg/L，4℃保存，可存放6個月；取1 000mg/L苯并（α）芘標準溶液1mL，定容至100mL，此溶液約含苯并（α）芘1mg/L；取1mg/L苯并（α）芘標準溶液100μL定容至10mL，此溶液約含苯并（α）芘10μg/L。

將苯并（α）芘標準貯備溶液稀釋為5種不同濃度溶液，每個溶液的濃度為1、2、4、8、10μg/kg；采用最佳液相色譜條件，每個濃度平行測定3次，以苯并（α）芘標準溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，作圖得苯并（a）芘的HPLC標準曲線。

1.2.3 色譜條件

色譜條件A（方法1-3）：流動相：乙腈∶超純水（88∶12）；設置泵：流速1.0mL/min；EX激發波長：384 nm，EM發射波長：406 nm（熒光檢測器）；PAH多環芳烴柱（C 18，5μm，4.6×150mm）；柱溫箱溫度：30℃；分析時間：30min。

色譜條件B（方法4）：色譜柱（Microsorb-MV 100-5 C 18，250×4.6mm×1/4＂）；柱溫30℃；流動相：乙腈-水（（88∶12，體積比）；流速1.0mL/min；進樣量20μL；檢測波長296 nm（紫外檢測器）。

1.2.4 計算公式

采用標準物質的保留時間對樣品峰進行準確定性，采用外標法以峰面積計算定量。

計算：C=c×v×n/m

式中：C為樣品中B（α）P的濃度，（μg/kg），c為由標準曲線查得提取液中B（α）P的含量，（μg/mL），v為提取液定容體積，mL，n為稀釋倍數，m為取樣質量，g。

2 結果與分析

2.1 樣品檢測結果

分別取大豆油一級、玉米油一級、芝麻油、花生油二級分別采用4種方法進行苯并（α）芘含量檢測，同一樣品同一方法做平行試驗，每個樣品2組，結果如下表1所示。

表1 樣品檢測結果Table1 The test results

2.2 標準曲線

色譜條件A：試驗結果表明，苯并（α）芘含量與峰面積的線性范圍為1μg/mL~10μg/mL；回歸方程（y為峰面積，x為濃度，μg/mL）為y=12 897x-284.24，相關系數為R2=0.99。

色譜條件B：試驗結果表明，苯并（α）芘含量與峰面積的線性范圍為0.1μg/mL~50μg/mL；回歸方程（y為峰面積，x為濃度，μg/mL）為y=3.199 98x-0.189 65，相關系數為R2=0.99。

2.3 檢測限

本試驗以3倍噪音比來確定最低檢出限，10倍噪音比來確定定量限。得到色譜條件A的最低檢出限為0.1μg/kg，色譜條件B的最低檢出限為2.8μg/kg。

2.4 精密度試驗

在選定的最佳色譜條件下，取含苯并（α）芘標準品于色譜條件A和色譜條件B分別重復進樣，考察精密度。結果如表2所示。

表2 色譜條件A和色譜條件B的精密度Table2 The precision of the chrom atographic conditions A and B

續表2色譜條件A和色譜條件B的精密度Continue tab le2 The precision of the chromatographic conditions A and B

2.5 回收率試驗

為考察4種方法的準確度，以不含苯并（α）芘的空白油樣為樣品，設計15μg/kg的添加濃度，計算苯并（α）芘的回收率，結果見表3。

表3 不同方法苯并（α）芘回收率Table3 Rateof recovery in differentm ethods

3 結果與討論

1）從樣品前處理方法來看，方法1與方法3使用試劑和操作方法差別不大，主要區別在于苯并芘SPE固定化萃取柱選用不同，方法1選用22 g/60mL柱，方法3選用500mg/6mL柱，方法3與方法1相比較最大的優勢是500mg/6mL柱的成本僅為22 g/60mL柱的三分之一，同時方法3前處理所用時間比方法1要短。方法2的操作步驟最為簡便快捷，省去了固定化萃取柱的成本，但由于此方法未對樣品中脂肪進行脫除，樣品進入色譜柱后會對柱效產生一定的影響，應用此方法需要定期對色譜柱效進行評估，定期更換色譜柱。方法4主要采用提取方法，節省了固定化萃取柱的成本，但此方法步驟較繁瑣，前處理花費時間略長。

2）從精密度試驗結果來看，色譜條件A與色譜條件B均能滿足檢測要求，色譜條件A精密度略高；前處理方法1-3中色譜條件A采用熒光檢測器，前處理方法4中色譜條件B采用紫外檢測器，對于大部分實驗室液相色譜均配備紫外檢測器，方法4可節省很大的儀器成本。最低檢出限相比，色譜條件A為0.1μg/kg，色譜條件B為2.8μg/kg，如對檢出限要求不要的檢測來說，方法4是很好的選擇。

3）從2.1中樣品檢測結果來看，應用前處理方法1、方法3和方法4的檢測結果比較穩定，重復性、標準偏差和相對標準偏差符合檢測要求，方法2的重復性較差，平行試驗檢測結果之間偏差較大。但方法2操作較便捷檢測時間短，應用前處理方法2平行試驗求平均值，對于生產型企業在線半定量檢測還是可以接受的方法。

苯并（α）芘作為食用油脂中十分重要的檢測指標，關系的企業的每個產品質量安全和食品安全，從原料采購到過程加工再到產品出廠檢驗，每一道工序必須進行嚴格的控制的檢測。對于食用油脂生產企業來說，既需要提高生產效率、降低成本又要保證產品的食品安全，所以開發一種準確、簡便、快速的檢測方法成為迫切需求。

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Edible Oil of Benzo（α）pyrene Detection M ethods of Com parison and Optim ization

SONGChang-hong1，TANGSheng2，TONGXin2，HAOKe-fei1，SHANGGang1，DENGBin1

（1.COFCO Northsea Oils&Grains Industries（Tianjin）Co.，Ltd.，Tianjin 300454，China；2.COFCO Oils Department of Quality&Safety，Beijing 100020，China）

Theedibleoilsbenzo（α）pyrene detectedmainly includessample pretreatmentand determination of basic processes，Because benzo（α）pyrene is the minimal content and poor stability in vegetable oil and complexityof the samplematrix such as triglyceridespotential interferencesestersand fatty accompaniment，etc. Sohow todetectbenzo（α）pyrene in the food quicklyand accurately，thatbecomesthe focusof the research stage. As thebasisof"animal fatbenzo（α）pyrenewasmeasured by RP-HPLC"of thenationalstandard GB/T22509-2008.Wemake optimizations for several samples preparation method and HPLC conditions and compare the results.

edible oil；benzopyrene；comparison；testmethod

2014-03-17

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.022

宋長虹（1959—），男（漢），高級工程師，本科，研究方向：油脂生產工藝。