高效液相色譜法測定潮州花生糖中的黃曲霉毒素B1

謝鴻，楊澤川，陳旭明

（廣東省食品質量監督檢驗站（潮州），廣東潮州521011）

高效液相色譜法測定潮州花生糖中的黃曲霉毒素B1

謝鴻，楊澤川，陳旭明

（廣東省食品質量監督檢驗站（潮州），廣東潮州521011）

建立免疫親和層析凈化-高效液相色譜法測定潮州花生糖中的黃曲霉毒素B1的檢測方法。樣品用甲醇-水（7+ 3）提取，定性濾紙和玻璃纖維濾紙2次過濾，過免疫親和柱凈化；洗脫液氮氣吹干后加正己烷和三氟乙酸衍生，以水-乙腈（85+15）溶解，用高效液相色譜儀帶熒光檢測器檢測。方法在0.002 5ng/μL~0.100 ng/μL的范圍內呈良好的線性關系，加標平均回收率為85.3%~92.9%，試驗的RSD為0.61%~1.08%。該方法通過改進柱前衍生化的條件和優化儀器分析條件，實驗結果重現性好，回收率高，結果準確，為黃曲霉毒素B1的檢測提供了準確可靠的方法。

免疫親和層析凈化；高效液相色譜法；黃曲霉毒素B1

在潮州方言里，潮州花生糖又叫豆方，是潮州正宗傳統特色小吃——配茶甜點。潮州人吃豆方有2個最傳統的日子，一個是中秋節前后，豆方是中秋祭拜月亮娘娘必備的祭品之一；另一個是結婚的時候，供客人享用并作為禮物帶走。潮汕地區有一個習俗，誰家娶媳婦的時候，都要分送鄰居豆方，潮州話稱為“食知”、“食甜”，也就是讓鄰居們知道自家的喜事。豆方制作的主要原料是花生，糖，麥芽糖。

霉菌毒素（mycotoxins），又稱真菌毒素，是某些霉菌在生長繁殖過程中產生的二次代謝有毒產物[1]。在所有霉菌毒素中，黃曲霉毒素的毒性、致癌性、污染頻率均居首位，是已知毒性最強的天然物質[2]，1993年被WHO癌癥研究機構劃定為Ⅰ類致癌物[3]。在天然污染的食品中存在的黃曲霉毒素以B1污染最多見，黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1簡寫為AFB1）是一類結構相似且具有較強毒性和致癌性的呋喃類化合物[4]，是目前已知的化學物質中致癌性最強的一種。黃曲霉毒素B1對包括人和若干動物具有強烈的毒性，其毒性作用主要是對肝臟的損害。黃曲霉毒素存在于土壤，動植物，各種堅果，特別是花生和核桃中，在曬干、儲存、加工原料花生的過程中，都會引入黃曲霉毒素[5]，黃曲霉毒素不僅毒性大、分布廣，而且結構也比較穩定，一般在食物的熱加工過程中都不易被破壞，因此給消費者的飲食安全埋下了巨大的隱患[2]。

黃曲霉毒素污染一直是食品及飼料行業極為關注的課題。近年來，隨著我國人民生活水平的提高，政府和人民群眾對食品質量的要求越來越高[6]。然而，要消除霉菌毒素造成的困擾卻不容易，其中一個非常重要的原因是這些毒素的濃度通常很低，難以用常規方法測出[1]，目前該類物質的檢測方法主要包括免疫分析法，薄層色譜法和高效液相色譜法，利用高效液相色譜法（HPLC）檢測黃曲霉毒素，是分析測試的一個主要方法。實驗材料選用地方特色食品潮州豆方為代表，因其制作過程大量使用花生為原料，黃曲霉毒素殘留的可能性較大，研究采用黃曲霉毒素免疫親和柱對樣品進行凈化，利用高效液相色譜儀進行定量分析。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、材料及耗材

1.1.1 儀器

安捷倫1260型HPLC帶熒光檢測器：檢測器型號：G1321B；EL-320S電子天平：常州天之平儀器設備有限公司；XW-80A旋渦混合器：上海醫科大學儀器廠；固相萃取裝置：艾貝爾科技有限公司；AP-01P真空泵：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；HGC-12A氮吹儀；DHG-9245A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司。

1.1.2 材料及耗材

市售花生糖；黃曲霉毒素B1免疫親和柱（Pribo－Fast IAC-010-3mL）；乙酸銨（分析純）、甲醇（色譜純）；乙腈（色譜純）、正己烷（分析純）、三氟乙酸、黃曲霉毒素B1標準液（Analytical Laboratory濃度：25μg/mL）。

1.2 溶液配制

1.2.1 標準儲備液

將黃曲霉毒素B1標準液（濃度：25μg/mL）1mL轉移到10mL容量瓶，用乙腈定容至刻度，配制成標準儲備液，此溶液濃度為2.5μg/mL，于4℃冰箱中保存，乙腈為色譜級試劑。

1.2.2 標準工作液

根據需要，將標準儲備液配制成適當濃度的標準工作液，標準工作液在使用前配制。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical（150mm×4.6mm，5μm）；進樣量：5μL；流速為1mL/min；柱溫為45℃；流動相為A-水∶B-乙腈∶C-甲醇∶D-20mmol/L乙酸銨（37∶19∶14∶30），等度洗脫；熒光檢測器波長：Ex=360、Em=440。

1.4 樣品處理。

1.4.1 提取

稱取均勻的樣品（6.00±0.05）g到50mL具塞比色管中，加30mL甲醇-水（7+3），渦旋混勻30min，定容至50mL，定性濾紙過濾，取5mL濾液，加水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，收集濾液待過黃曲霉毒素免疫親和柱。

1.4.2 凈化

黃曲霉毒素B1免疫親和柱，于使用前提前30min從4度冰箱中取出，上樣前讓柱子里的保護液全部流凈。取1.4.1收集的濾液全部過柱，用5mL水淋洗，抽干柱子，最后用1mL乙腈洗脫，整個過程流速控制不超過1mL/min，盡可能低流速，有利于目標物的吸附。

1.4.3 柱前衍生化

取洗脫液200μL，60℃下氮氣吹干，加入200μL正己烷和100μL三氟乙酸，密閉混勻30 s后，在（45± 1）℃烘箱中衍生25min后，于室溫下氮氣吹干，以200μL水-乙腈（85+15）溶解，混勻30 s，供高效液相色譜儀測定。

2 定性與定量

采用檢測器對化合物的色譜峰的保留時間定性、確證，并用外標峰面積法定量。黃曲霉毒素B1檢測結果計算公式為：

式中：X為樣品中黃曲霉毒素B1含量，（μg/kg）；c為標準曲線校準后試液中黃曲霉毒素B1的濃度，（ng/μL）；v為試液定容體積，mL；m為試樣質量，g；f為濃縮倍數。

3 結果

3.1 校正曲線

按選定的儀器條件對已配制的黃曲霉毒素B1標準系列溶液進行測量，以組分的質量濃度為橫坐標，組分的色譜峰面積為縱坐標，繪制校正曲線，校正曲線的回歸方程及相關系數如表1所示，校準曲線見圖1。

表1 校正曲線及相關系數Table1 Standard curveand correlation coefficient

圖1 黃曲霉毒素B1校正曲線Fig.1 Standard curveof aflatoxin B1

3.2 分析方法的準確度（回收率試驗）及精密度

以花生糖為實驗樣品（新鮮花生糖和已發霉花生糖），每個樣品分別稱取約6.00 g各3份，于新鮮花生糖中加入不同體積的黃曲霉毒素B1標準溶液0.5、1.0、1.5 ng/μL 3個濃度，按1.4的步驟進行樣品處理，處理成3個不同的加標濃度，分別為0.05、0.1、0.15 ng/μL；于發霉花生糖中加入不同體積的黃曲霉毒素B1標準溶液0.1、0.5、0.8 ng/μL 3個濃度，同樣按1.4的步驟進行樣品處理，處理成3個不同的加標濃度，分別為0.008、0.01、0.05 ng/μL；每個質量濃度測6次，測試的實驗數據見表2。測試標準溶液和樣品加標回收的色譜圖分別見圖2至圖6。

4 討論

從20世紀60年代初發現黃曲霉毒素以來，檢測黃曲霉毒素B1的檢測方法主要有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、酶聯免疫法（ELISA）、液相色譜串聯質譜法（LC/MS）等。黃曲霉毒素免疫親和柱HPLC法采用單克隆抗體免疫技術，可以特效地將黃曲霉毒素與其他真菌素分離出來，分離效率和回收率高。此方法已得到廣泛應用，并被美國官方分析化學家協會（AOAC）確認為官方檢測方法。

表2 加標回收試驗結果及精密度結果（n=6）Table2 Recoveriesand precision of them easured results（n=6）

圖2 黃曲霉毒素B1標準溶液0.012 5 ng/μL色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram ofaflatoxin B1standards（0.012 5 ng/μL）

圖3 新鮮花生糖空白樣品色譜圖Fig.3 HPLC chrom atogram of fresh peanutbrittle

圖4 空白樣品加標色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram ofblank samp leadd standard solution 0.1 ng/μL

圖5 發霉花生本底色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of thebackground ofmoldy peanutbrittle

圖6 本底濃度加標0.05 ng/μL色譜圖Fig.6 HPLC chrom atogram of thebackground ofmoldy peanut brittleadd standard solution 0.05 ng/μL

檢測前樣品使用免疫親和柱進行層析凈化，該柱采用高特異性和高親和力的的單克隆抗體，采用3mL柱管，柱容量高，可以有效的提高純化效率，符合國內外霉菌毒素限量標準，實驗結果證明具有良好的穩定性和可靠性，回收率可達90%。親和柱使用前應恢復到室溫，可以提高柱子的活性。樣品在提取時用的是甲醇-水（7+3），上柱子的樣品溶液取5mL，加水稀釋是降低樣品溶液中有機溶劑的含量（大概低至10%或以下），原因是因為有機溶劑溶度太高會破壞柱子中的單克隆抗體，降低對黃曲霉毒B1的特異性吸附，影響實驗結果；基于這種原因，在最后洗脫時，加1mL乙腈洗脫則要分2次加入，加入后讓其浸泡柱子中的吸附劑，充分溫育2min~5min，再低流速洗脫，原因是破壞抗體，使其與黃曲霉毒素B1分離，達到徹底的洗脫目標物。

采用高效液相色譜法檢測黃曲霉毒素B1，可以使用正相和反相液相色譜法進行，而反相因為操作比較容易，流動相毒性相對較低，因而被廣泛采用。樣品提取和凈化后，可以通過柱前衍生法和柱后衍生法，提高黃曲霉毒素B1檢測的靈敏度。柱前衍生法無需專用的柱后衍生反應系統，方法簡單，本實驗采用柱前衍生法，通過加入三氟乙酸進行衍生，通過適當提高衍生的溫度和時間，可以更好的增強黃曲霉毒素B1的熒光強度，提高檢測靈敏度。日本CSC相關實驗數據證明，經過三氟乙酸衍生的黃曲霉毒素B1比未經過衍生的保留時間提前一半，峰面積增加近20倍，峰高則增加近30倍，可見經過衍生可以顯著增強檢測靈敏度。

研究用免疫親和柱層析凈化-高效液相色譜法檢測黃曲霉毒素，因為酶聯免疫吸附法僅能檢測單一毒素（如黃曲霉毒素B1）含量，而且易出現假陽性結果，難以控制；TLC法樣品前處理繁瑣，且提取和凈化效果不夠理想，提取液中雜質較多，在展開時影響斑點的熒光強度；免疫親和柱的使用可以避免傳統TLC和HPLC的缺點，它采用單克隆抗體免疫技術，可以特效性地將黃曲霉毒素或其他真菌毒素分離出來，分離效率和回收率高。克服了TLC和HPLC法在操作過程中使用劇毒的真菌毒素作為標定標準物和在樣品預處理過程中使用多種有毒，異味的有機溶劑，毒害操作人員和污染環境的缺點，因而免疫親和柱-高效液相色譜法比傳統的HPLC法更加安全，可靠，兩者結合可以大大提高工作效率，提高靈敏度和準確度，應用于質量檢測部門對黃曲霉毒素B1的檢測，效果滿意。

[1]朱聰英,應永飛,韋敏玨,等.液相色譜-串聯質譜法測定飼料中黃曲霉毒素的研究[J].質譜學報,2010,31(4):240-246

[2]莫彩娜,楊曦,黃智成.高效液相色譜-串聯質譜法測定水產品中黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1[J].廣州化工,2011,39(20):92-94

[3]楊琳,張宇昊,馬良.高效液相色譜法同時檢測糧谷中的黃曲霉毒素和赭曲霉毒素[J].食品科學,2010,31(24):250-254

[4]付朝暉,黃雪祥,閔順耕.超高效液相色譜法快速測定發酵茶葉中的黃曲霉毒素[J].分析試驗室,2009,28(6):112-115

[5]蔡增軒,潘紅峰,王麗麗,等.應用超高壓液相-質譜聯用技術同時測定花生及其制品中的6種黃曲霉毒素[J].中國衛生檢驗雜志, 2009(5):970-974

[6]高軍俠,倪余文,萬昊雷,等.過柱純化-高效液相色譜法測定玉米黃曲霉毒素[J].生態學雜志,2005,24(8):967-969

Determ ination of Aflatoxin B1in Chaozhou Peanut Brittle by High Performance Liquid Chromatography

XIEHong，YANG Ze-chuan，CHEN Xu-ming

（Food Quantity Supervision and Inspection station of Guangdong（Chaozhou），Chaozhou 521011，Guangdong，China）

A method was developed for the determination of Aflatoxin B1 in Chaozhou peanut brittle by Immunoaffinity chromatography and High Performance Liquid Chromatography.Samplesextracted withmethanol -water（7+3），filtered with qualitative filter paper and glass fiber filter paper，purified by immunoaffinity column；Eluatewasdriedwith nitrogen，and derived byn-hexaneand trifluoroaceticacid，dissolvedwithwateracetonitrile（85+15）and detected by high performance liquid chromatographywith fluorescence detection.The calibration curvesare linearbetween 0.002 5 ng/μLand 0.100 ng/μL.The rateofaverage recovery ofaflatoxin B1was85.3%-92.9%，and RSDs ranged from 0.61%to1.08%.In thispaper，optimized the condition ofHPLCand theconditionsofpre-column derivatization，themethod has theadvantagesofsimplicity，rapidity，precision，good reproducibilityand high recovery，so thatitcould beused for thedetermination ofaflatoxin B1，and itcanmeetthe need ofmeasuring in food safety control.

immunoaffinity chromatography；HPLC；aflatoxin B1

2013-08-07

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.024

謝鴻（1981—），男（漢），工程師，本科，主要從事食品檢測-儀器分析方面的工作。