現代蛋白質分離純化技術

張彩喬 耿風廷

（華北制藥金坦生物技術股份有限公司，河北 石家莊 050000）

0 概述

蛋白質的分離純化在現代醫學、藥學、生物化學等方面使用廣泛，是一項關鍵核心技術。尤其是隨著生物制藥的迅猛發展，蛋白質作為藥品中的一部分應用越來越廣泛，而作為藥品，如何將目的蛋白進行分離提純就顯得尤為重要。

每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學活性都會有差異。蛋白質分離提純就是利用不同蛋白間內在的相似性與差異，將目的蛋白從其他蛋白中純化出來。現在生物制藥研究中，尤其是大規模生物制藥生產上，蛋白質分離純化技術主要應用各項層析技術，其中包括親和層析、離子交換層析、反相層析、疏水層析、分子篩層析等等。

1 親和層析

在生物分子中有些分子的特定結構部位能夠同其他分子相互識別并結合，如酶與底物的識別結合、受體與配體的識別結合、抗體與抗原的識別結合，這種結合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結合解除。生物分子間的這種結合能力稱為親和力。親和層析就是根據這樣的原理設計的蛋白質分離純化方法。

將具有特殊結構的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當要被分離的蛋白混合液通過層析柱時，與吸附劑具有親和能力的蛋白質就會被吸附而滯留在層析柱中。那些沒有親和力的蛋白質由于不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質分開，然后選用適當的洗脫液，改變結合條件將被結合的蛋白質洗脫下來。

2 離子交換層析

離子交換層析是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。

離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陽離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陰離子樹脂。離子交換層析同樣可以用于蛋白質的分離純化。由于蛋白質也有等電點，當蛋白質處于不同的pH 條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH 值洗脫下來。

3 反相層析

在吸附層析中，高極性物質在層析柱上吸附較牢，洗脫時發生拖尾現象和保留時間長的問題。如果在支持物上涂上一層高碳原子的疏水性強的烷烴類，洗脫液用極性強的溶劑，如甲醇和水的混合物。則被分離樣品中的極性強的物質不被吸附，最先洗下來，得到較好的分離效果。這種層析法與普通的吸附層析法相反，故稱為反相層析。

4 疏水層析

疏水層析和反相層析（reversed phase chromatography）分離蛋白質的依據是一致的，利用固定相載體上偶聯的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發生可逆性結合而進行分離。該方法基于的是蛋白質的疏水差異，蛋白質表面一般有疏水與親水集團，疏水層析是利用蛋白質表面某一部分具有疏水性，與帶有疏水性的載體在高鹽濃度時結合。在洗脫時，將鹽濃度逐漸降低，因其疏水性不同而逐個地先后被洗脫而純化，可用于分離其它方法不易純化的蛋白質。

一般而言，離子強度（鹽濃度）越高，物質所形成的疏水鍵越強。影響疏水作用的因素包括：鹽濃度，溫度，pH，表面活化劑和有機溶劑。疏水層析的應用與離子交換層析的應用剛好互補，因此，可以用于分離離子交換層析很難或不能分離的物質。

5 分子篩層析

分子篩層析又稱為凝膠層析或凝膠過濾。分子篩層析是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相，.對混合物中各組分按分子大小進行分離的層析技術。具有分子篩作用的物質很多，如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等，其中以葡聚糖凝膠應用最廣。

凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質，當帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內運動時，由于它們的分子量不同而表現出速度的快慢，在緩沖液洗脫時，分子量大的物質不能進入凝膠孔內，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運動，而分子量小的物質則進入凝膠孔內進行“繞道”運行，這樣就可以按分子量的大小，先后流出凝膠柱，達到分離的目的。

6 蛋白分離純化過程中的注意事項

由于蛋白質只有在其天然結構狀態下才具有活性，才能具備相應的功能。因此，在進行任何一種蛋白質純化的時候，都要時刻注意維護它的穩定性，保護它的活性，無論進行何種層析，都需要注意以下方面：

1）生產過程中考慮操作溫度，尤其是目的蛋白穩定性較差的樣品，最好置于冰上或者在冷庫內進行操作；即使是對溫度不敏感的樣品，也應控制操作溫度不超過室溫，溫度過高會導致蛋白緩慢變性。

2）樣品濃度要控制在一定范圍內，蛋白濃度維持在μg/mL～mg/mL。

3）選用合適pH 的緩沖液，所使用的緩沖溶液pH 避免與蛋白質等電點相同，防止蛋白質的沉淀。

4）避免樣品反復凍融和劇烈攪動，以防蛋白質的變性。

5）純化用緩沖溶液的溫度盡量控制穩定，溫度過低則容易導致層析過程中產生氣泡，溫度過高則容易使蛋白質變性。

6）盡量保證各步分離純化過程緊密相連，減少樣品放置時間，因純化過程為非無菌過程，如拖延時間過長，會導致樣品中菌量增加，進而導致樣品內毒素水平急劇升高。

7 展望

隨著科學技術的不斷發展，國家對藥品監管力度的不斷加強，以及生物制藥領域市場競爭日益激烈，如何更好更快的將目的蛋白提純就愈發顯得重要，不僅要求純化收率的提高，更要保證分離純化的純度和質量。現在針對不同產品、不同蛋白質研發其專屬的、特異性的層析技術、層析介質就成為蛋白質分離純化領域一個重要的發展方向。