食品微生物的檢測能力驗證

舒鵑娟等

能力驗證（proficiency testing）即利用實驗室間比對，按照預先制定的準則評價參加者的能力。通過能力驗證能夠評定實驗室從事特定檢測或測量的能力，識別實驗室存在的問題并啟動改進措施，提高實驗室的檢測能力等。因此，參加能力驗證活動對實驗室質量控制有著非常重要的意義。上海市閘北區疾病預防控制中心實驗室已連續多年參加遼寧出入境檢驗檢疫局食品微生物能力驗證計劃，現將從中收獲的一些經驗教訓介紹如下，供同行參考。

1.2.2操作步驟

① 按照PTC-T028參試指導書的要求進行樣品水化。從冰箱取出待測樣品，待其恢復至室溫后，無菌開啟裝有樣品的西林瓶，立即加入4 mL生理鹽水進行再水化，稀釋液合計40 mL，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，反復用余下的稀釋液清洗西林瓶內壁，回收清洗液放入上述無菌瓶中，此溶液即是待測樣品原液，全過程20 min內完成。將上述制備的40 mL待測原液按照標準方法進行后續操作。

② 菌落總數檢測。取經水化制備的待測原液25 mL，加入225 mL滅菌生理鹽水混勻，制成10-1稀釋液，取10-1稀釋液1 mL加9 mL滅菌生理鹽水混勻，制成10-2稀釋液，以此類推稀釋至10-4。每稀釋1次，換1次無菌吸管。每個稀釋度樣液各取1 mL加入到2個無菌平皿中，同時做空白對照。及時用15 mL冷卻至45℃左右的平板計數瓊脂傾注平皿，搖勻，待培養基凝固后倒置放入培養箱中，36℃培養48 h后進行菌落計數。

③ 大腸菌群檢測。采用最可能數（most probable number，MPN）法進行大腸菌群計數。將經水化的待測樣品按照菌落總數檢測的方法制備10-1～10-6的稀釋液。每個稀釋度接種3管LST肉湯，每管接種1 mL，36℃培養48 h后，產氣者進行復發酵試驗，接種BGLB肉湯管36℃培養48 h后產氣者計為大腸菌群陽性，記錄每個稀釋度的BGLB產氣管數。

④ 金葡菌檢測。取經水化制備的待測原液25 mL，加入225 mL 7.5%NaC1肉湯制成混懸液，于36℃培養20 h，轉種血平板和Baird-Parker平板，于36℃培養24 h，挑取可疑菌落進行鑒定。

⑤ 沙門菌檢測。取經水化制備的待測原液25 mL，加入225 mL BPW制成混懸液，于36℃培養18 h后，分別取1 mL轉種TTB 10 mL及SC 10 mL， TTB置42℃培養24 h，SC置36℃培養24 h，分別轉種BS平板內于36℃培養48 h及沙門菌屬顯色平板，于36℃培養24 h，挑取可疑菌落進行鑒定。

⑥ 單增檢測。取經水化制備的待測原液25 mL，加入225 mL LB1制成混懸液，于30℃培養24 h后，吸取0.1 mL轉種于10 mL LB2中，置30℃培養24 h，轉種于PALCAM平板和李斯特菌顯色平板，36℃培養48 h，挑取可疑菌落進行鑒定。

⑦ 志賀菌檢測。取經水化制備的待測原液25 mL，加入225 mL志賀菌增菌液制成混懸液，于41.5℃厭氧培養20 h后轉種XLD及MAC平板，于36℃培養24 h，挑取可疑菌落進行鑒定。

⑧ 副溶血性弧菌檢測。取經水化制備的待測原液25 mL，加入225 mL APW制成混懸液，于36℃培養16 h，轉種TCBS及弧菌顯色平板，于36℃培養24 h，挑取可疑菌落進行鑒定。

3討論

本實驗室參加的7項能力驗證試驗反饋結果均為滿意（《食品中微生物學能力驗證計劃PTC-T028結果報告》），表明本實驗室能很好地應用國家標準（GB 4789，現行有效系列）開展相關項目的檢測。本次能力驗證的定量項目中，菌落總數和大腸菌群的滿意率分別為90.5%和89.7%；定性項目中金葡菌滿意率最高，78個結果反饋僅1個為不滿意，滿意率為98.7%；副溶血性弧菌滿意率最低，56個結果反饋中，49個為滿意，滿意率為87.5%。此外，組織方將每一個項目分成不同組別，本實驗室副溶血性弧菌項目被分配到指定值為陽性組，有26個結果反饋，只有20個為滿意，滿意率為76.9%。

在參加能力驗證活動時，需要注意以下幾方面：

實驗前要仔細閱讀參試指導書，按照其要求對樣品進行前處理。對于定量項目來說，西林瓶中的樣品是一個不可分割的整體，應全部溶解用于檢測，不能只取一部分進行檢測而造成結果不準確。樣品打開后應立即水化，否則會導致樣品吸潮溶解困難，影響準確計數。在樣品稀釋過程中要充分混勻，以免影響計數結果的準確性。采用傾注法對樣品計數的項目，在傾注培養基后應搖動平板以保證細菌均勻分布，以免造成蔓延生長影響計數結果。由于MPN法是基于泊松分布的一種間接計數方法，其計數原理是將待測樣品作一系列稀釋，一直稀釋到將少量的稀釋液接種到新鮮培養基中沒有或極少出現細菌生長繁殖，然后根據沒有生長的最低稀釋度與出現生長的最高稀釋度，采用“最可能數”理論，查MPN表計算得出樣品單位體積中細菌數的近似值。所以采用MPN法對樣品計數的項目在操作時應稀釋足夠的倍數，以達到出現生長的最高稀釋度，并謹慎選擇計數的稀釋度，即選擇的3個稀釋度既要包括所有重復都有菌液生長的最高稀釋度，又要包括出現生長的最高稀釋度，否則會影響MPN法的計數結果。

對于定性項目來說，保證培養基的質量，選擇適合的培養基，檢測人員的操作水平和經驗判斷都非常重要。每批次培養基應做好質控，并在有效期內使用。在首次分離培養時，建議使用弱選擇性培養基，這是因為冷凍干燥過程可能造成細胞內核酸的損傷而誘導突變體的產生，可能導致目標菌在強選擇性培養基上也無法生長。建議使用顯色培養基，更方便有效地將目標菌和雜菌區分開來。在劃線分離時，要盡可能多的分出單個菌落。能準確識別選擇性平板上的可疑菌落，進行后續鑒定時，應挑取盡可能多的可疑菌落，以免因挑取的菌落數量太少沒有取到目標菌而造成假陰性。認真完成所有的鑒別試驗再做出判斷，以免因判斷依據不足而影響檢測結果。在實驗過程中，應設置陰、陽性對照，避免假陰性或假陽性結果出現而影響結果判斷。

綜上所述，能力驗證是證明實驗室檢測能力的一種科學有效的技術手段，是對實驗室檢測技術能力和管理狀況進行考核的客觀方法，是實驗室質量控制的重要手段，對實驗室資質認定工作有效性的后續監督有著非常重要的作用。實驗室能力驗證試驗結果的準確性，與實驗室的工作技術水平直接相關。參加能力驗證計劃獲得滿意結果，能增強客戶及相關方對實驗室出具可靠數據的信心。通過能力驗證活動，實驗室能了解自身不足，有利于督促其加強自身能力建設，提高實驗室人員檢測技術水平，增加檢測結果的正確性和可靠性。

4參考文獻

[1]中國合格評定國家認可委員會.能力驗證規則＼[S＼].2010.

[2]食品衛生微生物學檢驗大腸菌群計數. GB 4789.3—2010＼[S＼].

[3]McCrady MH.The numerical interpretation of fermentation- tube results＼[J＼].Infect Dis，1915，17：183-212.

[4]孫慧，李天添.大腸菌群MPN計數法與CFU計數法相關性初探＼[J＼].釀酒，2012，39（3）：93-94.

[5]黃瑤，崔邦炳，黃翠姬，等.利用真空冷凍干燥法保藏幾種常見細菌的研究＼[J＼].廣西工學院學報，2006，17（2）：20-22.

能力驗證（proficiency testing）即利用實驗室間比對，按照預先制定的準則評價參加者的能力。通過能力驗證能夠評定實驗室從事特定檢測或測量的能力，識別實驗室存在的問題并啟動改進措施，提高實驗室的檢測能力等。因此，參加能力驗證活動對實驗室質量控制有著非常重要的意義。上海市閘北區疾病預防控制中心實驗室已連續多年參加遼寧出入境檢驗檢疫局食品微生物能力驗證計劃，現將從中收獲的一些經驗教訓介紹如下，供同行參考。

1.2.2操作步驟

① 按照PTC-T028參試指導書的要求進行樣品水化。從冰箱取出待測樣品，待其恢復至室溫后，無菌開啟裝有樣品的西林瓶，立即加入4 mL生理鹽水進行再水化，稀釋液合計40 mL，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，反復用余下的稀釋液清洗西林瓶內壁，回收清洗液放入上述無菌瓶中，此溶液即是待測樣品原液，全過程20 min內完成。將上述制備的40 mL待測原液按照標準方法進行后續操作。

② 菌落總數檢測。取經水化制備的待測原液25 mL，加入225 mL滅菌生理鹽水混勻，制成10-1稀釋液，取10-1稀釋液1 mL加9 mL滅菌生理鹽水混勻，制成10-2稀釋液，以此類推稀釋至10-4。每稀釋1次，換1次無菌吸管。每個稀釋度樣液各取1 mL加入到2個無菌平皿中，同時做空白對照。及時用15 mL冷卻至45℃左右的平板計數瓊脂傾注平皿，搖勻，待培養基凝固后倒置放入培養箱中，36℃培養48 h后進行菌落計數。

③ 大腸菌群檢測。采用最可能數（most probable number，MPN）法進行大腸菌群計數。將經水化的待測樣品按照菌落總數檢測的方法制備10-1～10-6的稀釋液。每個稀釋度接種3管LST肉湯，每管接種1 mL，36℃培養48 h后，產氣者進行復發酵試驗，接種BGLB肉湯管36℃培養48 h后產氣者計為大腸菌群陽性，記錄每個稀釋度的BGLB產氣管數。

④ 金葡菌檢測。取經水化制備的待測原液25 mL，加入225 mL 7.5%NaC1肉湯制成混懸液，于36℃培養20 h，轉種血平板和Baird-Parker平板，于36℃培養24 h，挑取可疑菌落進行鑒定。

⑤ 沙門菌檢測。取經水化制備的待測原液25 mL，加入225 mL BPW制成混懸液，于36℃培養18 h后，分別取1 mL轉種TTB 10 mL及SC 10 mL， TTB置42℃培養24 h，SC置36℃培養24 h，分別轉種BS平板內于36℃培養48 h及沙門菌屬顯色平板，于36℃培養24 h，挑取可疑菌落進行鑒定。

⑥ 單增檢測。取經水化制備的待測原液25 mL，加入225 mL LB1制成混懸液，于30℃培養24 h后，吸取0.1 mL轉種于10 mL LB2中，置30℃培養24 h，轉種于PALCAM平板和李斯特菌顯色平板，36℃培養48 h，挑取可疑菌落進行鑒定。

⑦ 志賀菌檢測。取經水化制備的待測原液25 mL，加入225 mL志賀菌增菌液制成混懸液，于41.5℃厭氧培養20 h后轉種XLD及MAC平板，于36℃培養24 h，挑取可疑菌落進行鑒定。

⑧ 副溶血性弧菌檢測。取經水化制備的待測原液25 mL，加入225 mL APW制成混懸液，于36℃培養16 h，轉種TCBS及弧菌顯色平板，于36℃培養24 h，挑取可疑菌落進行鑒定。

3討論

本實驗室參加的7項能力驗證試驗反饋結果均為滿意（《食品中微生物學能力驗證計劃PTC-T028結果報告》），表明本實驗室能很好地應用國家標準（GB 4789，現行有效系列）開展相關項目的檢測。本次能力驗證的定量項目中，菌落總數和大腸菌群的滿意率分別為90.5%和89.7%；定性項目中金葡菌滿意率最高，78個結果反饋僅1個為不滿意，滿意率為98.7%；副溶血性弧菌滿意率最低，56個結果反饋中，49個為滿意，滿意率為87.5%。此外，組織方將每一個項目分成不同組別，本實驗室副溶血性弧菌項目被分配到指定值為陽性組，有26個結果反饋，只有20個為滿意，滿意率為76.9%。

在參加能力驗證活動時，需要注意以下幾方面：

實驗前要仔細閱讀參試指導書，按照其要求對樣品進行前處理。對于定量項目來說，西林瓶中的樣品是一個不可分割的整體，應全部溶解用于檢測，不能只取一部分進行檢測而造成結果不準確。樣品打開后應立即水化，否則會導致樣品吸潮溶解困難，影響準確計數。在樣品稀釋過程中要充分混勻，以免影響計數結果的準確性。采用傾注法對樣品計數的項目，在傾注培養基后應搖動平板以保證細菌均勻分布，以免造成蔓延生長影響計數結果。由于MPN法是基于泊松分布的一種間接計數方法，其計數原理是將待測樣品作一系列稀釋，一直稀釋到將少量的稀釋液接種到新鮮培養基中沒有或極少出現細菌生長繁殖，然后根據沒有生長的最低稀釋度與出現生長的最高稀釋度，采用“最可能數”理論，查MPN表計算得出樣品單位體積中細菌數的近似值。所以采用MPN法對樣品計數的項目在操作時應稀釋足夠的倍數，以達到出現生長的最高稀釋度，并謹慎選擇計數的稀釋度，即選擇的3個稀釋度既要包括所有重復都有菌液生長的最高稀釋度，又要包括出現生長的最高稀釋度，否則會影響MPN法的計數結果。

對于定性項目來說，保證培養基的質量，選擇適合的培養基，檢測人員的操作水平和經驗判斷都非常重要。每批次培養基應做好質控，并在有效期內使用。在首次分離培養時，建議使用弱選擇性培養基，這是因為冷凍干燥過程可能造成細胞內核酸的損傷而誘導突變體的產生，可能導致目標菌在強選擇性培養基上也無法生長。建議使用顯色培養基，更方便有效地將目標菌和雜菌區分開來。在劃線分離時，要盡可能多的分出單個菌落。能準確識別選擇性平板上的可疑菌落，進行后續鑒定時，應挑取盡可能多的可疑菌落，以免因挑取的菌落數量太少沒有取到目標菌而造成假陰性。認真完成所有的鑒別試驗再做出判斷，以免因判斷依據不足而影響檢測結果。在實驗過程中，應設置陰、陽性對照，避免假陰性或假陽性結果出現而影響結果判斷。

綜上所述，能力驗證是證明實驗室檢測能力的一種科學有效的技術手段，是對實驗室檢測技術能力和管理狀況進行考核的客觀方法，是實驗室質量控制的重要手段，對實驗室資質認定工作有效性的后續監督有著非常重要的作用。實驗室能力驗證試驗結果的準確性，與實驗室的工作技術水平直接相關。參加能力驗證計劃獲得滿意結果，能增強客戶及相關方對實驗室出具可靠數據的信心。通過能力驗證活動，實驗室能了解自身不足，有利于督促其加強自身能力建設，提高實驗室人員檢測技術水平，增加檢測結果的正確性和可靠性。

4參考文獻

[1]中國合格評定國家認可委員會.能力驗證規則＼[S＼].2010.

[2]食品衛生微生物學檢驗大腸菌群計數. GB 4789.3—2010＼[S＼].

[3]McCrady MH.The numerical interpretation of fermentation- tube results＼[J＼].Infect Dis，1915，17：183-212.

[4]孫慧，李天添.大腸菌群MPN計數法與CFU計數法相關性初探＼[J＼].釀酒，2012，39（3）：93-94.

[5]黃瑤，崔邦炳，黃翠姬，等.利用真空冷凍干燥法保藏幾種常見細菌的研究＼[J＼].廣西工學院學報，2006，17（2）：20-22.

能力驗證（proficiency testing）即利用實驗室間比對，按照預先制定的準則評價參加者的能力。通過能力驗證能夠評定實驗室從事特定檢測或測量的能力，識別實驗室存在的問題并啟動改進措施，提高實驗室的檢測能力等。因此，參加能力驗證活動對實驗室質量控制有著非常重要的意義。上海市閘北區疾病預防控制中心實驗室已連續多年參加遼寧出入境檢驗檢疫局食品微生物能力驗證計劃，現將從中收獲的一些經驗教訓介紹如下，供同行參考。

1.2.2操作步驟

① 按照PTC-T028參試指導書的要求進行樣品水化。從冰箱取出待測樣品，待其恢復至室溫后，無菌開啟裝有樣品的西林瓶，立即加入4 mL生理鹽水進行再水化，稀釋液合計40 mL，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，反復用余下的稀釋液清洗西林瓶內壁，回收清洗液放入上述無菌瓶中，此溶液即是待測樣品原液，全過程20 min內完成。將上述制備的40 mL待測原液按照標準方法進行后續操作。

② 菌落總數檢測。取經水化制備的待測原液25 mL，加入225 mL滅菌生理鹽水混勻，制成10-1稀釋液，取10-1稀釋液1 mL加9 mL滅菌生理鹽水混勻，制成10-2稀釋液，以此類推稀釋至10-4。每稀釋1次，換1次無菌吸管。每個稀釋度樣液各取1 mL加入到2個無菌平皿中，同時做空白對照。及時用15 mL冷卻至45℃左右的平板計數瓊脂傾注平皿，搖勻，待培養基凝固后倒置放入培養箱中，36℃培養48 h后進行菌落計數。

③ 大腸菌群檢測。采用最可能數（most probable number，MPN）法進行大腸菌群計數。將經水化的待測樣品按照菌落總數檢測的方法制備10-1～10-6的稀釋液。每個稀釋度接種3管LST肉湯，每管接種1 mL，36℃培養48 h后，產氣者進行復發酵試驗，接種BGLB肉湯管36℃培養48 h后產氣者計為大腸菌群陽性，記錄每個稀釋度的BGLB產氣管數。

④ 金葡菌檢測。取經水化制備的待測原液25 mL，加入225 mL 7.5%NaC1肉湯制成混懸液，于36℃培養20 h，轉種血平板和Baird-Parker平板，于36℃培養24 h，挑取可疑菌落進行鑒定。

⑤ 沙門菌檢測。取經水化制備的待測原液25 mL，加入225 mL BPW制成混懸液，于36℃培養18 h后，分別取1 mL轉種TTB 10 mL及SC 10 mL， TTB置42℃培養24 h，SC置36℃培養24 h，分別轉種BS平板內于36℃培養48 h及沙門菌屬顯色平板，于36℃培養24 h，挑取可疑菌落進行鑒定。

⑥ 單增檢測。取經水化制備的待測原液25 mL，加入225 mL LB1制成混懸液，于30℃培養24 h后，吸取0.1 mL轉種于10 mL LB2中，置30℃培養24 h，轉種于PALCAM平板和李斯特菌顯色平板，36℃培養48 h，挑取可疑菌落進行鑒定。

⑦ 志賀菌檢測。取經水化制備的待測原液25 mL，加入225 mL志賀菌增菌液制成混懸液，于41.5℃厭氧培養20 h后轉種XLD及MAC平板，于36℃培養24 h，挑取可疑菌落進行鑒定。

⑧ 副溶血性弧菌檢測。取經水化制備的待測原液25 mL，加入225 mL APW制成混懸液，于36℃培養16 h，轉種TCBS及弧菌顯色平板，于36℃培養24 h，挑取可疑菌落進行鑒定。

3討論

本實驗室參加的7項能力驗證試驗反饋結果均為滿意（《食品中微生物學能力驗證計劃PTC-T028結果報告》），表明本實驗室能很好地應用國家標準（GB 4789，現行有效系列）開展相關項目的檢測。本次能力驗證的定量項目中，菌落總數和大腸菌群的滿意率分別為90.5%和89.7%；定性項目中金葡菌滿意率最高，78個結果反饋僅1個為不滿意，滿意率為98.7%；副溶血性弧菌滿意率最低，56個結果反饋中，49個為滿意，滿意率為87.5%。此外，組織方將每一個項目分成不同組別，本實驗室副溶血性弧菌項目被分配到指定值為陽性組，有26個結果反饋，只有20個為滿意，滿意率為76.9%。

在參加能力驗證活動時，需要注意以下幾方面：

實驗前要仔細閱讀參試指導書，按照其要求對樣品進行前處理。對于定量項目來說，西林瓶中的樣品是一個不可分割的整體，應全部溶解用于檢測，不能只取一部分進行檢測而造成結果不準確。樣品打開后應立即水化，否則會導致樣品吸潮溶解困難，影響準確計數。在樣品稀釋過程中要充分混勻，以免影響計數結果的準確性。采用傾注法對樣品計數的項目，在傾注培養基后應搖動平板以保證細菌均勻分布，以免造成蔓延生長影響計數結果。由于MPN法是基于泊松分布的一種間接計數方法，其計數原理是將待測樣品作一系列稀釋，一直稀釋到將少量的稀釋液接種到新鮮培養基中沒有或極少出現細菌生長繁殖，然后根據沒有生長的最低稀釋度與出現生長的最高稀釋度，采用“最可能數”理論，查MPN表計算得出樣品單位體積中細菌數的近似值。所以采用MPN法對樣品計數的項目在操作時應稀釋足夠的倍數，以達到出現生長的最高稀釋度，并謹慎選擇計數的稀釋度，即選擇的3個稀釋度既要包括所有重復都有菌液生長的最高稀釋度，又要包括出現生長的最高稀釋度，否則會影響MPN法的計數結果。

對于定性項目來說，保證培養基的質量，選擇適合的培養基，檢測人員的操作水平和經驗判斷都非常重要。每批次培養基應做好質控，并在有效期內使用。在首次分離培養時，建議使用弱選擇性培養基，這是因為冷凍干燥過程可能造成細胞內核酸的損傷而誘導突變體的產生，可能導致目標菌在強選擇性培養基上也無法生長。建議使用顯色培養基，更方便有效地將目標菌和雜菌區分開來。在劃線分離時，要盡可能多的分出單個菌落。能準確識別選擇性平板上的可疑菌落，進行后續鑒定時，應挑取盡可能多的可疑菌落，以免因挑取的菌落數量太少沒有取到目標菌而造成假陰性。認真完成所有的鑒別試驗再做出判斷，以免因判斷依據不足而影響檢測結果。在實驗過程中，應設置陰、陽性對照，避免假陰性或假陽性結果出現而影響結果判斷。

綜上所述，能力驗證是證明實驗室檢測能力的一種科學有效的技術手段，是對實驗室檢測技術能力和管理狀況進行考核的客觀方法，是實驗室質量控制的重要手段，對實驗室資質認定工作有效性的后續監督有著非常重要的作用。實驗室能力驗證試驗結果的準確性，與實驗室的工作技術水平直接相關。參加能力驗證計劃獲得滿意結果，能增強客戶及相關方對實驗室出具可靠數據的信心。通過能力驗證活動，實驗室能了解自身不足，有利于督促其加強自身能力建設，提高實驗室人員檢測技術水平，增加檢測結果的正確性和可靠性。

4參考文獻

[1]中國合格評定國家認可委員會.能力驗證規則＼[S＼].2010.

[2]食品衛生微生物學檢驗大腸菌群計數. GB 4789.3—2010＼[S＼].

[3]McCrady MH.The numerical interpretation of fermentation- tube results＼[J＼].Infect Dis，1915，17：183-212.

[4]孫慧，李天添.大腸菌群MPN計數法與CFU計數法相關性初探＼[J＼].釀酒，2012，39（3）：93-94.

[5]黃瑤，崔邦炳，黃翠姬，等.利用真空冷凍干燥法保藏幾種常見細菌的研究＼[J＼].廣西工學院學報，2006，17（2）：20-22.