信號轉導和轉錄激活子3抑制劑WP1066作為神經病理性疼痛治療新靶點的可行性

薛照靜，申 樂，王之遙，黃宇光

中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院麻醉科，北京 100730

·論 著·

信號轉導和轉錄激活子3抑制劑WP1066作為神經病理性疼痛治療新靶點的可行性

薛照靜，申 樂，王之遙，黃宇光

中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院麻醉科，北京 100730

目的 觀察Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)/信號轉導和轉錄激活子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)通路抑制劑WP1066對神經病理性疼痛的影響。方法 12只體重180～200 g 雌性SD大鼠用隨機數字表法分為WP1066組及對照組(n=6)，均行雙側坐骨神經結扎手術，兩組于術前1 d、術前及術后第3、5天分別經鞘內注射容量為10 μl的WP1066(10 mmol/L溶于二甲基亞砜)或二甲基亞砜，于術前及術后第3、5、7、10、14天進行動物行為學檢測，觀察大鼠對機械、熱及丙酮冷刺激的反應。術后第14天處死大鼠，于L4～L6腰膨大脊髓背角處取材，使用RT-PCR及Western blot檢測STAT3、細胞因子信號抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)、JAK2 mRNA及蛋白水平。結果 大鼠機械縮足反射閾值、熱刺激縮足反射潛伏期和冷痛閾值分別從第3、5、5天開始，WP1066組較對照組明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比，WP1066組STAT3、SOCS3、JAK2 mRNA表達均明顯降低(P<0.05)；WP1066組磷酸化STAT3、SOCS3、JAK2蛋白水平均亦明顯降低(P<0.05)。結論 WP1066可明顯改善大鼠神經病理性疼痛，可能為治療神經病理性疼痛提供新的靶點。

神經病理性疼痛；JAK/STAT通路；WP1066；雙側坐骨神經結扎

MedJPUMCH,2014,5(2):142-147

神經病理性疼痛是由神經系統原發性損害和功能障礙所激發或引起的疼痛。神經系統與免疫系統之間的相互作用，為治療神經病理性疼痛提供了新的靶點。在中樞神經系統，Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)/信號轉導和轉錄激活子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)通路導致炎癥、腫瘤及神經退行性變[1]，并且參與神經病理性疼痛的形成過程。細胞因子信號抑制因子(suppressors of cytokine signaling，SOCS)是一類對細胞因子和生長相關因子信號轉導通路起負性調節的蛋白家族，尤其是SOCS3對JAK/STAT信號通路發揮負反饋調節作用，參與抑制炎癥及凋亡等保護作用。本研究組前期研究發現，JAK2/STAT3在大鼠雙側坐骨神經結扎(bilateral chronic sciatic nerve constriction injury, bCCI)模型中是激活的[2]。WP1066是一種新的且具有細胞滲透性的AG490衍生物。但是與AG490不同，WP1066除了能夠有效抑制 STAT3信號通路，還可以降解 JAK2蛋白，從而阻止下游STAT3通路的激活。此外，正常細胞活性不受WP1066的影響,其作用是增強免疫的細胞毒性，而不是體液反應。WP1066可通過血腦屏障，也有研究表明WP1066治療癲癇有效[3]，提示WP1066可以作為一種大腦損傷后的治療手段。但是目前尚未見該抑制劑用于治療神經病理性疼痛的相關研究報道。因此，本研究通過觀察WP1066對神經病理性疼痛的影響，旨在為治療神經病理性疼痛尋找新的方案。

材料和方法

實驗動物

SPF級健康雌性SD大鼠，體重180～200 g，由北京動物研究所[許可證SCXK(京)：20022003]提供，飼養于北京協和醫院動物實驗中心。室溫22 ℃左右，相對濕度50%左右，明暗各12 h，自由攝水和食物，每日更換籠具和墊料。適應環境3～5 d后行鞘內置管。

鞘內置管

采用腹腔注射戊巴比妥鈉40～50 mg/kg麻醉大鼠。取俯臥位，消毒，鋪巾，在無菌操作下以大鼠脊柱正中髂嵴連線水平為中心作縱切口，切開皮膚，打開筋膜，分離肌肉，暴露L5～L6棘突間隙，分離棘間韌帶后暴露黃韌帶。用去尖磨鈍的22G針頭穿刺黃韌帶，觀察到大鼠身體突然抽動或甩尾后立即拔針，用鑷子輕柔地將PE- 10導管向頭側置入蛛網膜下腔內約3 cm，見腦脊液流出或注入生理鹽水可見腦脊液回流，證實導管通暢后封閉管口，在髂嵴處用絲線固定。用止血鉗作一皮下隧道，將導管沿隧道前端穿出，固定于皮膚。局部生理鹽水沖洗切口，間斷縫合肌肉筋膜、皮下組織及皮膚；術畢將大鼠放入單籠，于溫暖、安靜環境中自由喂養。手術由同一人操作以保證一致性。

鞘內管一直保留至實驗結束，術后觀察2 d以排除傷口感染、鞘內感染、鞘內管阻塞、脫位、痛覺異常和運動障礙大鼠，沒有異常表現的大鼠鞘內注射2%利多卡因10 μl，如注藥30 s內未出現雙后肢麻痹，則認為鞘內置管失敗，棄去不用。注藥后出現雙后肢麻痹的動物分籠單獨飼養，即可用于實驗。實驗結束后剖開大鼠腰椎再次確認導管位置。

雙側坐骨神經結扎手術

按照隨機數字表法將12只SD大鼠隨機分為WP1066組及對照組，每組6只，兩組均進行bCCI手術。戊巴比妥40～50 mg/kg進行腹腔注射麻醉后，消毒，鋪巾，在距坐骨神經起始處 (三支分叉處)上方2 mm用4.0含鉻羊腸線結扎神經4道，每兩道之間間隔約1 mm，使被結扎的神經長約4～5 mm。在解剖顯微鏡(×40)下觀察可見坐骨神經表面的動脈輕度受壓，但血流沒有中斷；注意結扎的松緊度,以打結時可見切口周圍暴露的肌肉產生輕微抽動為準；間斷縫合；對側同樣操作。手術由同一人操作。

鞘內給藥

WP1066組及對照組分別于術前1d、術前、術后3 d、術后5 d經鞘內管給予容量為10 μl的WP1066(Santa-Ctuze, 美國，10 mmol/L溶于二甲基亞砜)或10 μl的二甲基亞砜。

行為學觀察

兩組均于bCCI模型手術前1 d及術后3、5、7、10、14 d進行動物行為學測量及觀察。

機械刺激誘發痛測定：采用電子von Frey測痛儀測定。參照Vivancos等[4]方法，大鼠安靜地適應環境10～30 min后，用金屬探頭垂直刺激大鼠左、右后腳底。刺激強度逐漸增大，大約3 s內使大鼠后腳產生快速縮足、揚足或舔足反應。記錄儀自動記錄使大鼠產生縮足反射的最小刺激強度。反復該刺激動作，直至記錄儀記錄到3次數值類似的測試值。將3次讀數取平均值作為機械縮足反射閾值。

熱刺激誘發痛測定：采用BME- 410A熱照射疼痛刺激儀測定。大鼠安靜地適應環境10～30 min后，用熱測痛儀照射大鼠左、右后腳底，待大鼠產生快速縮足、揚足或舔足后停止照射，記錄下照射持續時間即為縮足反射的潛伏期。每足重復測量3次，每兩次測量至少間隔3 min。將3次讀數取平均值作為熱刺激傷害感受閾值，最高閾值設為20 s，因高于20 s對正常大鼠也可以引起疼痛。

冷刺激誘發痛測定：參照Datta等[5]方法，大鼠適應環境15 min后，用帶有軟管接頭的1 ml注射器，將0.1 ml丙酮輕柔地滴加在大鼠后足上。隨著丙酮在大鼠腳掌的擴散，大鼠出現抬足、縮足、快速甩足以及甩足后舔足等反應視為陽性表現，間隔2 min重復1次，每只后足重復3次。記錄每只大鼠后足3次丙酮刺激后出現陽性表現的次數，作為冷痛閾值。

動物處死及取材

術后第14天，腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉(劑量約40 mg/kg)，深度麻醉后斷頭處死大鼠。取俯臥位，迅速剪開背部皮膚，沿棘突切開皮膚及皮下組織，用咬骨鉗分別咬去椎板及椎弓根,暴露脊髓，小心取出L4～L6腰膨大脊髓背角, 立即放入液氮冷卻5～10 min后放入-80 ℃冰箱保存。

RT-PCR反應

Trizol法提取RNA：分別提取WP1066組和對照組L4～L6腰膨大脊髓背角的RNA。用紫外分光光度儀測定每個RNA樣本濃度并進行質量鑒定。如RNA樣本的OD260/OD280值在1.8～2.1之間，則認為RNA的純度較好，否則棄之不用，記錄合格樣本的RNA濃度。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，通過凝膠成像系統檢測所提取的RNA，可觀察到28S和18S核糖體RNA帶亮而濃。

cDNA合成：合格RNA樣本按照PrimeScriptTMRT Master Mix(Takara DRR036A，塔克拉，日本)說明加入試劑，反應條件為37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃，到無窮；進行逆轉錄反應合成cDNA。

RT-PCR：引物設計選用GAPDH基因作為內參，運用Primer Premier 5.0和Oligo 6軟件進行引物設計，各基因引物設計見表1。cDNA模板按照SYBR Premix ExTaqTMⅡ(Takara RR820A，塔克拉，日本)說明進行RT-PCR反應，每個樣品同時做3個復管。將所測標本放入AB Applied Biosystems Step-one plus(ABI，美國)進行PCR反應，反應條件包括預變性：95 ℃ 30 s；PCR反應：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s；循環40個反應體系；溶解：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反應結束后，電腦自動分析熒光信號并將其轉換為Ct值。PCR結束后分別運行熔解曲線確定PCR產物的特異性，另將反應產物經瓊脂糖凝膠電泳再次確認其單一性；各樣品的目的基因和內參基因分別進行反應。計算各樣品目的基因和內參基因的相對濃度。

Western blot

組織中總蛋白的提取：用干凈的剪刀將脊髓背角組織塊盡量剪碎(冰上操作)。按照每20 μg加150～250 μl RIPA(或單去污劑)裂解液(加蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑)進行勻漿。裂解后4 ℃下12 000轉/min(r=13.5 cm)離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中。使用BCA法，通過微孔酶標儀制作標準曲線測定蛋白濃度。

表 1 RT-PCR目的基因引物序列

SDS-PAGE電泳：按照分子量大小選擇配8%或12%分離膠， 取40 μg樣品及8 μl彩染蛋白分子量指示標準SDS-PAGE膠(10 cm×10 cm)上樣。 80 V電壓電泳直到跑出濃縮膠，120 V電壓電泳直至蛋白指示劑移動到膠的底部。300 mA恒流轉膜75 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。一抗4 ℃過夜，分別為抗pSTAT3抗體(1∶500; Cell Signaling Technology)、抗STAT3抗體(Tyr705, 1∶500; Cell Signaling Technology)、抗SOCS3 抗體(1∶100; Santa Cruz Biotechnology, Inc)、抗JAK2抗體 (1∶500; Santa Cruz Biotechnology, Inc)。TBST緩沖液清洗3遍，二抗孵育，輕度震蕩，室溫放置1 h。ImageQuant LAS 4000mini凝膠成像儀進行曝光。

統計學處理

數據分析采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0軟件進行；表格繪制使用Excel軟件。對于定量資料，數據使用均數±標準差表示，對于不同組間的機械痛閾、熱痛閾的比較采用重復測量方差分析，再進行配對t檢驗，對于冷刺激誘發痛的數據分析采用卡方檢驗(Pearson chi-squared test)進行比較。實時PCR結果采用ABI Step-one plus自帶軟件進行數據分析，之后采用2-ΔΔCT法計算基因表達量，再進行配對t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

兩組大鼠動物行為學變化

大鼠bCCI手術前后左右后足平均機械痛閾值、熱刺激傷害感受閾值、冷刺激反應差異均無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比，WP1066組機械縮足反射閾值從第3天開始明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；熱刺激縮足反射潛伏期從第5天開始明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；冷痛閾值從第5天開始明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖1)。

兩組大鼠脊髓背角STAT3、SOCS3、JAK2 及IL- 6 mRNA表達

對照組及WP1066組STAT3 mRNA相對表達量分別為1.97±0.14與1.03±0.08；SOCS3 mRNA相對表達量分別為3.32±1.12和1.02±0.19；JAK2 mRNA相對表達量分別為3.49±0.89和1.62±1.27，與對照組相比，WP1066組STAT3、SOCS3、JAK2 mRNA表達均明顯降低，差異有統計學意義(P均<0.05)。WP1066組IL- 6 mRNA表達較對照組稍升高，相對表達量分別為1.62±1.27和1.36±0.36，差異亦具有統計學意義(P<0.05)。

兩組大鼠脊髓背角pSTAT3、STAT3、SOCS3及JAK2蛋白水平

以GAPDH為內參基因，觀察兩組大鼠脊髓背角pSTAT3、STAT3、SOCS3及JAK2蛋白表達變化，結果顯示，與對照組相比，WP1066組pSTAT3、SOCS3、JAK2蛋白水平均明顯降低，差異均具有統計學意義(P均<0.05)；STAT3蛋白水平亦有所降低，但差異無統計學意義(P>0.05)(圖2)。

討 論

本研究組前期研究發現JAK2/STAT3 通路在bCCI神經病理性疼痛模型中是激活的[2]，本研究嘗試探求JAK2/STAT3抑制劑對神經病理性疼痛的影響。結果與研究假設相符，發現JAK2/STAT3抑制劑WP1066可以較好地改善神經病理性疼痛閾值，并且WP1066對通路的影響符合預期分子機制。

圖 1 不同刺激誘發大鼠疼痛行為學變化結果 A.機械刺激；B.熱刺激；C.冷刺激；與對照組比較，*P<0.05

圖 2 靶蛋白在大鼠脊髓背角的表達情況 A.pSTAT3；B.STAT3；C.SOCS3；D.JAK2 STAT3：信號轉導和轉錄激活子3；pSTAT3：磷酸化STAT3；SOCS3：細胞因子信號抑制因子3；JAK2：Janus激酶2;Mr:相對分子質量；與對照組比較，*P<0.05

與傳統的神經病理性疼痛模型相比，本研究采用的bCCI模型為雙側模型，雖相關研究較少，但更具備合理性。一方面，隨著大鼠體重的日益增加，手術側重量與非手術側重量失衡，導致手術側對刺激的敏感度失真，造成結果的失真。另一方面，動物取材為大鼠脊髓背角，雙側取材比單側取材更具有精確性。因此利用bCCI模型建立神經病理性疼痛大鼠模型更具優越性。并且，疼痛持續時間越長，這種優勢越明顯。此外，本研究采用180～200 g雌性SD大鼠，則是由于雌性、小體重鼠對疼痛更為敏感。選擇術后第14天取材是由于bCCI模型術后第14天疼痛閾值達到最低點，且前期研究發現目的基因在第14天變化最顯著。

與單側CCI模型相比，bCCI模型對冷刺激出現痛覺過敏[6]。Aδ纖維參與冷刺激[7]。bCCI疼痛模型對冷刺激的反應包括兩個階段[5]：早期表現為機械和冷刺激敏感，晚期(>30 d)表現為長時間冷痛覺過敏及接觸痛。本研究定在早期階段。有研究表明，冷刺激過敏與TRPM8在神經元上表達有關[8]。本研究表明bCCI神經病理性疼痛模型中，WP1066可在mRNA 水平及蛋白水平抑制JAK2/STAT3通路的活化。SOCS3與JAK2/STAT3通路之間是負反饋調節。WP1066，無論是在mRNA 水平還是蛋白水平均可以顯著降低SOCS3的含量。也可能提示此通路相關蛋白在冷痛覺傳導中發揮作用。

機械痛感和熱痛感是 以Aδ纖維和C纖維為痛感受器[9]通過背根到達脊髓背角。bCCI疼痛模型對熱過敏可能與Wallerian樣變性及巨噬細胞浸潤神經相關[10]。從人膠質細胞瘤上分離的小膠質細胞和星形膠質細胞缺乏CD86和CD80，從而不能激活天然T細胞。而在其他神經病理性疼痛模型中，發現脊髓小膠質細胞[11]及星形膠質細胞[12]參與JAK2/STAT3 通路的活化。WP1066作用機制為抑制JAK2/STAT3通路，使T細胞功能化[13]，從而發揮抗炎鎮痛作用。本研究也發現WP1066可在mRNA 水平及蛋白水平抑制JAK2/STAT3通路的活化，符合預期結果。IL- 6在神經病理疼痛的發生發展中與熱痛覺及機械痛關系密切，在神經病理性疼痛中起著重要作用。Dubovy等[14]在大鼠CCI模型發現除了L4～L5 脊髓背角神經元IL- 6激活，還可通過激活STAT3通路，導致神經病理性疼痛的發生。Dominguez等[12]發現結扎脊神經L5～L6會導致3、7、14 d后脊髓背根神經節IL- 6 mRNA的表達均顯著升高。但是，本研究發現WP1066對IL- 6 mRNA的影響與預期相反，分析IL- 6水平的升高可能由其他原因造成。

本研究在bCCI大鼠給藥后，大鼠雙足熱刺激誘發痛閾值、機械刺激縮足反射閾值均出現顯著恢復，大鼠神經病理性疼痛明顯減輕。預實驗時分別鞘內給予0、5、10、15 μl的WP1066，結果顯示與10 μl劑量相比，15 μl 劑量時疼痛行為學并未出現明顯改善，反而出現劑量依賴型體重下降。因此最終采用鞘內注射劑量為10 μl。

近年來，銀杏肉堿B[15]和雷公藤[16]均被證明可通過JAK2/STAT3通路發揮脊髓損傷后的神經保護作用，提示JAK2/STAT3通路抑制劑可能在治療神經病理性疼痛中有一定的潛力。WP1066對JAK2/STAT3信號通路的影響，可為神經病理性疼痛的有效治療提供新靶點。但由于WP1066價格昂貴，且對皮膚黏膜有一定的刺激作用，所以本研究采用經鞘內給藥的方法，未來可嘗試使用新的劑型應用于臨床。

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Feasibility of Signal Transducers and Activators of Transcription 3 Inhibitor WP1066 as a Novel Target for Neuropathic Pain

XUE Zhao-jing, SHEN Le，WANG Zhi-yao, HUANG Yu-guang

Department of Anesthesiology, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College, Beijing 100730，China

HUANG Yu-guang Tel: 010-69155580, E-mail:garybeijing@163.com

Objective To evaluate whether the Janus kinase 2(JAK2)/signal transducers and activators of transcription 3 (STAT3)inhibitor WP1066 could be a novel therapeutic target for neuropathic pain and its molecular mechnism. Methods Twelve female SD rats weighing 180-200 g were randomly divided into WP1066 group and control group(n=6) using the random number table. Rats in both groups underwent bilateral chronic sciatic nerve constriction injury (bCCI). WP1066 (10 μl, 10 mmol/L in dimethyl sulfoxide) or the equal volume of dimethyl sulfoxide was applied through the intrathecal tube one day before surgery, just before surgery, and 3 and 5 days after surgery in the WP1066 group and control group, respectively. Behavior tests were performed before surgery and 3, 5, 7, 10, and 14 days after the surgery to observe the rats’ reactions to mechanical, thermal, and cold stimula-

tions. The rats were killed on the 14th postoperative day. The dorsal horn of the spinal cord (L4-L6) was harvested, followed by the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting to investigate the activation of the JAK2/STAT3 pathway. Results The pain-related behavior changes were significantly better in the WP1066 group than in the control group. WP1066 significantly inhibited the JAK2, suppressor of cytokine signaling 3(SOCS3), and STAT3 mRNA in rats with bCCI, and significantly decreased the ratio of JAK2, SOCS3 and phosphorylation of STAT3(p-STAT3) protein expression on the 14th postoperative day. Conclusions The administration of WP1066 can remarkably improve neuropathic pain in bCCI rats by inhibiting the STAT3 signaling pathway. Therefore, WP1066 may be a novel target for neuropathic pain.

neuropathic pain; JAK/STAT signaling pathway; WP1066；bilateral chronic sciatic nerve constriction injury

國家自然科學基金面上項目(31070930)和青年科學基金項目(81200869)

黃宇光 電話：010-69155580，E-mail：garybeijing@163.com

R614

A

1674-9081(2014)02-0142-06

10.3969/j.issn.1674-9081.2014.02.003

2013- 10- 22)