高效產芽孢除磷菌株的篩選鑒定及影響其除磷的因素

石儉，李紅亞，李術娜，朱寶成

（河北農業大學 生命科學學院，河北 保定 071001）

水體富營養化已經成為全球普遍存在的環境問題，而引起水體富營養化的關鍵因素是磷［1－2］，所以有效防治水體污染和富營養化的主要途徑就是降低廢水中磷的含量.特別是近年來，除磷工藝研究有了很大進展［3－5］，當前廢水除磷的方法主要包括：生物法、膜技術處理法、化學沉淀法、物理吸附法等.我國現在多數的污水處理主要是有機磷的去除，而去除率只有10%～20%，和國家二級排放標準相差還很大.生物除磷具有處理低能耗、效率高、運行成本低、不使用化學藥劑、避免二次污染等優點，因而生物除磷成了當前的研究熱點［6］，并且具有很好的應用前景.

現已報道的生物除磷菌株主要包括：脫氮微球菌屬、假單胞菌屬、棒桿菌屬、腸桿菌屬、氣單胞菌屬等［7］，菌株除磷能力一般為60%～90%，但這些菌株大多存在對自然環境耐受性差、不易繁殖培養、活性易于衰退等弊端，在實際使用中活菌數量不高，造成使用效果難以保證.

產芽孢菌株的強抗逆性可以避免以上弊端［8］，因此本研究擬分離篩選出具有較高除磷能力的產芽孢菌株，以期為高效除磷菌株在實際污水生物除磷中的應用推廣提供新的菌種資源、理論依據和技術支持.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采自保定郊區、河北農大西校區以及競秀公園附近的河流、湖泊底污泥共5份樣品，編號后放入瓶中封口置于4 ℃冰箱備用，3d內處理完畢.

1.2 培養基

1）NA 培養基（g／L）：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，瓊脂20，pH 7.2～7.4.

2）NB培養基：不加瓊脂的NA 培養基.

3）富集培養基：在NB培養基中加入20mg／L的KH2PO4［9］.

4）初篩培養基——無機磷培養基（g／L）：葡萄糖10，（NH4）2SO40.5，NaCl 0.3，KCl 0.3，MgSO4·7H2O 0.3，Fe－SO4·7H2O 0.03，MnSO4·7H2O 0.03，Ca3（PO4）25.0，瓊脂20，蒸餾水1 000mL，pH 7.0～7.5.

5）缺磷培養基（g／L）：CH3COONa 2.00，Na2HPO4·2H2O 0.023，CaCl2·2H2O 0.011，NH4Cl 0.152 8，MgSO4·7H2O 0.08，K2SO40.02和2mL的微量元素，pH 7.2.

6）富磷培養基（g／L）：CH3COONa 2.00，K2HPO40.025，NH4Cl 0.305 52，MgSO4·7H2O 0.091 26，CaCl2·2H2O 0.025 68和2mL的微量元素.

7）微量元素溶液（g／L）：FeCl30.904 4，H3BO30.15，CuSO4·5H2O 0.03，KI 0.18，MnCl2·4H2O 0.06，ZnSO4·7H2O 0.12，CoCl2·7H2O 0.15，Na2MoO4·2H2O 0.06，乙二胺四乙酸10.

8）LB培養基（g／L）：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，pH 7.2.

9）菌種生理生化鑒定培養基：參見《常見細菌系統鑒定手冊》［10］.

1.3 試劑的配置

1）過硫酸鉀溶液：將5g K2S2O8（分析純）溶解于水，稀釋至100mL.

2）抗壞血酸溶液：將10g C6H8O6（分析純）溶解于水，稀釋至100mL.在4 ℃下，儲存于棕色試劑瓶.

3）鉬酸鹽溶液、磷標準儲備溶液及磷標準使用溶液的配制見參考文獻［11］.

4）生理生化實驗所需試劑參照《常見細菌系統鑒定手冊》［10］配制.

1.4 工業污水

取自保定市西魯崗污水處理廠，磷的質量濃度為3.6mg／L.

1.5 實驗方法

1.5.1 菌株的富集培養

稱取10g樣品于100mL無菌水中，充分振蕩后將菌懸液80 ℃水浴15min，取5mL 熱處理后菌懸液接種于富集培養基中，30 ℃，180r／min搖床培養24h后取5mL 培養液轉接于新鮮的富集培養基中，按以上方法重復3次.

1.5.2 菌株的分離純化

將最終的富集培養液進行系列梯度稀釋后涂布于NA 平板，在30 ℃條件下培養24h，將菌落形態不同的單菌落轉接至NA 平板中劃線檢測［12］純度后于4 ℃條件下保存備用.

1.5.3 除磷菌株的篩選及除磷率的測定

將分離到的菌株點接到無機磷培養基的固體平板上，30 ℃培養3d，觀察并記錄，將具有水解圈［11］的菌株進入后續研究，其他菌株則淘汰.

將具有水解圈的菌株接入NB培養基中活化，然后按4%接種量接入到缺磷培養基中，30 ℃，180r／min預培養24h 后，按6%的接種量轉接入富磷液體培養基中，30 ℃，180r／min 搖床培養48h，將培養液5 000r／min離心10min，采用鉬銻分光光度法［13］測定培養基上清液中的磷（PO3－4）含量，同時以不接菌且做同樣處理的培養基作為對照.

除磷率＝（空白培養基中磷的含量－接菌后培養基上清液中磷的含量）／空白培養基磷的含量×100%.

1.5.4 菌株異染粒的觀察

選擇除磷能力最高的復篩菌株進行異染顆粒染色實驗，具體方法參見文獻［10］.

1.5.5 除磷菌株的應用條件研究

以富磷培養基作為基礎培養基，將培養基pH 值分別調整為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，測定不同pH 值對菌株除磷能力的影響.

在最適pH 值條件下，在富集培養基中分別加入0.05g／L 的輔助碳源（葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖）和0.05g／L的輔助氮源（豆餅粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、玉米粉），調整成最適pH 值，按6%接種量接入種齡為12h的3－6菌株的種子液，30℃，180r／min搖床培養24h后對發酵液上清測定除磷效果，考察輔助碳、氮源對除磷菌株除磷能力的影響，以不接菌的培養基作對照.

1.5.6 菌株對工業污水的實際除磷能力的測定

將200mL工業廢水加入500mL的三角瓶，添加最適的輔助碳氮源，調制最適pH 值，按6%接種量接菌，30 ℃，180r／min搖床培養48h，測定其中磷含量的變化.以上處理3個平行，以不接菌且加入同等碳氮源的污水作為對照.

1.5.7 菌株的種屬鑒定

1）將供試菌株活化后在NA培養基平板上進行劃線，觀察菌株培養24h后的菌落形態，參照《常見細菌系統鑒定手冊》將活化好的供試菌種進行革蘭氏及結晶紫染色，利用光學顯微鏡觀察供試菌株的菌體和芽孢的形態.

2）參照常見的細菌鑒定手冊［10，14－17］進行生理生化實驗.

3）DNA 的提取及16SrDNA 的擴增：提取細菌基因組DNA 采用試劑盒（康為世紀生物技術公司）進行，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質量.

PCR 反應體系：DNA 模板2.5μL，10×Taq Buffer（含Mg2＋）4.5μL，dNTP 3.5μL，27F1.5μL，1 495F1.5μL，Taq DNA 聚合酶0.5μL，ddH2O 35μL.

PCR 條件為：94 ℃預變性5min；94 ℃變性40s，58 ℃退火30s，72 ℃延伸90s，共進行31個循環；之后72 ℃延伸10min.PCR 產物經試劑盒純化后，送上海生工生物工程技術公司進行測序.

4）16SrDNA 序列分析及系統發育樹的構建：利用BLAST 的方式將供試菌株測定的16SrDNA 序列在GenBank中進行比對，獲得與供試菌株相應16SrDNA 序列，構建系統發育樹［18］.

2 結果與分析

2.1 除磷菌株的分離與篩選

采集的5份樣品經加熱處理與富集培養，分離純化后得到64株細菌，其中28株具有除磷能力，其初篩磷水解圈見圖1.

2.2 除磷菌株除磷率的測定

2.2.1 磷標準曲線的測定

通過對波長600nm 下不同磷質量濃度的OD 值的測量，以磷質量濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標作圖得到了磷的標準曲線即磷質量濃度與OD 值對應關系（圖2），由此進行線性分析得出線性回歸方程y＝0.018 x.由R2＝0.999可知此標準曲線的線性關系良好，達到了實驗計算的要求.

圖1 初篩水解圈Fig.1 Hydrolysis circle of preliminary screening

圖2 磷標準曲線Fig.2 Standard curve of preliminary

2.2.2 各菌株除磷率的測定

對初篩所得菌株進行缺磷與富磷連續培養，然后測定各菌株的除磷率，結果見表1.結果表明，28株菌中3－6的除磷率最高，達到34.63%.

表1 菌株的除磷率Tab.1 Phosphorus removal rate of strains

2.3 菌株3－6異染粒的觀察

經涂片顯微觀察，菌株3－6具有異染粒（圖3）.

異染粒是一種多除磷酸鹽顆粒，是一種磷酸鹽儲藏物，是與脂類和蛋白質相結合的多聚偏磷酸鹽.相關文獻報道［19］，異染粒和菌株的除磷特性密切相關.以上結果表明，菌株3－6 不僅表現出較高的除磷能力，而且經染色觀察含有異染粒，因此將其作為后續研究的菌株.

2.4 除磷菌株的應用條件研究

通過測定不同pH 值對菌株的除磷能力的影響，結果表明6.0為最佳pH 值（圖4）.

圖3 異染粒染色觀察Fig.3 Observation of metachromatic granule

圖4 不同pH 值對除磷率的影響Fig.4 Influence on phosphorus removal ability of different pH value

在最適pH 條件下，在富集培養基中分別添加不同的輔助碳氮源后接入菌株3－6，培養48h，以不接菌的培養基作為對照，測定各組除磷率如圖5所示，實驗結果表明：淀粉為最佳的輔助碳源，蛋白胨為最佳的輔助氮源.

圖5 不同的輔助碳、氮源對除磷能力的影響Fig.5 Influence on phosphorus removal ability of different auxiliary carbon and nitrogen sources

碳源和氮源是異養微生物進行新陳代謝的重要影響因素，已有研究表明［7］，碳源的種類和結構對生物除磷工藝中微生物的生長和除磷有著重要調節作用.由以上結果可見，加入輔助碳、氮源后菌株除磷能力與加入之前相比明顯提高，輔助氮源為蛋白胨時除磷率可達92.21%，玉米粉組中除磷率為91.03%，相差不大.但玉米粉的價格要明顯低于蛋白胨，因此選用玉米粉.玉米粉與淀粉均屬于工業副產物，價格低廉，來源廣泛.加入輔助碳氮源雖然成本略有增加，但可以大幅度提高磷的去除能力，綜合評價此方法還是值得引薦的.

2.5 菌株對工業污水實際除磷能力的測定

在最佳輔助碳氮源及pH 值條件下，測定菌株3－6對工業廢水的除磷效果（表2）.結果表明，當處理時間為48h時除磷率為96.86%，且48h后由于營養物質的耗盡及pH 值等條件的變化致使除磷率不再增大.菌株3－6在廢水中的除磷率高于一般文獻報道的化學吸附除磷率［20］，本研究采用的污水所含的磷主要為無機磷，較容易被菌株分解、吸收、利用等，才使除磷率比較高.但是本論文研究是在實驗室內模擬進行的，因此在污水處理廠或實際應用時還需進一步研究.

表2 不同時間菌株對工業廢水的除磷效果Tab.2 Phosphorus removal of industrial wastewater effect by strain of different time

2.6 菌株3－6的種屬鑒定

2.6.1 形態觀察

菌株3－6在NA 培養基平板上培養24h后的菌落形態呈圓形，表面濕潤、光滑，邊緣整齊而無皺褶，不透明，不產生色素，如圖6.經染色后在油鏡下觀察，革蘭氏染色呈陽性，菌體大小為（0.5～0.7）μm ×（1.7～2.0）μm，長桿狀，芽孢呈橢圓形，中生，大小為（0.6～0.8）μm ×（1.0～1.5）μm，胞內基質染色均勻（圖7）.

圖6 菌株3－6在NA平板上的菌落形態Fig.6 Colonial morphology of the strain 3－6

圖7 菌株3－6菌體形態Fig.7 Morphology of the strain 3－6

2.6.2 生理生化實驗結果

供試菌株3－6的生理生化實驗結果見表3.

表3 菌株3－6生理生化實驗結果Tab.3 Physiological and biochemical characteristics of the strain 3－6

根據以上實驗結果，與《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》［9］中的標準菌株進行對比，可知3－6菌株與芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）中的蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）很相近，初步鑒定為蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）.

2.6.3 菌株3－6的16SrDNA 基因序列分析及同源性比較

以菌株3－6的DNA 為模板進行16SrDNA 序列的擴增，將PCR 產物送去測序，將測定的序列進行比對后建立其系統發育樹.將3－6菌株與相關的標準菌株進行相似度比較，與蠟狀芽孢桿菌的同源相似度最高（表4），為98.65%.綜合以上3－6菌株的形態、生理生化特征鑒定及16SrRDNA 序列分析結果，鑒定菌株3－6為蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）.

表4 3－6菌株與相關參比標準菌株的相似度比較Tab.4 Comparison of the similarities between several related reference standard stains and the stain 3－6

續表4Continue tab.4

圖8 以菌株3－6的16SrDNA序列為基礎的系統發育樹Fig.8 Phylogenetic tree base on the 16SrDNA sequence of the strain 3－6

3 討論

本研究分離篩選出的高效除磷菌株3－6蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）用于污水除磷在國內外文獻還未見報道，研究結果為修復廢水磷污染發現了新菌株.芽孢桿菌具有較強的抗逆性，易于實現大工業發酵生產，且生產菌劑及應用過程中倉儲期更長，活性穩定性更好，可在使用過程中保持較高的生物量，從而保證使用效果.

菌株充分發揮其除磷能力，需要菌株的大量繁殖以及正確充分的代謝途徑，因此，為菌株提供合適的營養與外部環境條件，對于促進其除磷能力的提高很有必要.研究明確了輔助營養成分和起始pH 等環境因子對3－6菌株除磷能力的影響，在成本允許的范圍內使菌株除磷能力有了質的提高，探明了其適用條件和應用效果，為水體磷污染的微生物修復途徑奠定了科學基礎，此思路對于其他菌株除磷能力的提高具有借鑒意義.

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