活性炭吸附羅非魚下腳料蛋白酶解液及對風味成分的影響

李利敏，楊萍，張冠洲，洪鵬志

（廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室，廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088）

羅非魚是淡水養(yǎng)殖業(yè)的重要養(yǎng)殖品種之一，也是聯(lián)合國糧農組織推廣養(yǎng)殖的種類之一[1]。目前全世界已有85個國家和地區(qū)養(yǎng)殖羅非魚，年產量約200多萬t。2006年我國羅非魚產量超過100萬t，占世界總產量的一半以上。廣東具備養(yǎng)殖羅非魚的得天獨厚的優(yōu)越條件，是我國養(yǎng)殖羅非魚最早、養(yǎng)殖面積最多和產量最高的地區(qū)。在冷凍羅非魚片的加工中，魚片利用率只占整條魚的40%左右，造成大量浪費，還容易對環(huán)境造成污染，而羅非魚下腳料的主要成分是蛋白質，其蛋白酶解液有很高的營養(yǎng)價值，因此對羅非魚加工下腳料的綜合利用，可以降低羅非魚的加工成本，提高羅非魚的利用價值和經濟價值。但是蛋白酶解液顏色較深、腥苦味較重，這給蛋白酶解液的應用帶來了很大阻礙，如何解決這類問題，成為羅非魚下腳料蛋白酶解液開發(fā)利用的關鍵問題。活性炭具有良好的吸附脫色特性，是食品工業(yè)中廣泛使用的吸附澄清劑，已有關于活性炭對海洋蛋白酶解液脫腥脫色的研究[2-4]，但多以研究吸附工藝條件為主，少見有關于活性炭吸附對風味物質的影響的研究報道。本文用活性炭吸附處理羅非魚下腳料蛋白酶解液，研究了吸附對脫色、蛋白質損失以及風味物質的影響，以期為羅非魚下腳料蛋白酶解液的有效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

羅非魚下腳料：湛江市恒興水產科技有限公司提供，包括內臟、魚頭和魚骨，去除內臟清洗干凈，經絞肉機絞碎分裝后，凍藏于實驗室－18℃冷柜中備用。

活性炭（食品級Y-200）：長葛市通達活性炭廠；蛋白酶：木瓜蛋白酶：酶活力65×104U/g，中性蛋白酶：酶活力20×104U/g，廣西南寧市龐博生物工程有限公司。

1.2 主要儀器設備

離心機；pH計；722S型紫外可見分光光度計；恒溫水浴鍋；GC-MS；同時蒸餾萃取裝置等。

1.3 方法

1.3.1 酶解液的制備

羅非魚下腳料自然解凍后，料液比 1∶2，pH7.0，于55℃的恒溫水浴鍋中，先加入中性蛋白酶水解1 h，后加入木瓜蛋白酶繼續(xù)水解2 h（酶用量均為1 100 U/g原料），然后于90℃水浴滅酶10 min，冷卻后，8 000 r/min離心15 min，去除上層油脂與下層殘渣，中間層為酶解液。

1.3.2 吸附試驗

酶解液中加入一定量的活性炭，在一定的pH、溫度下吸附一段時間后，4 500 r/min離心20 min去除活性炭，進行脫色率、蛋白質損失率的測定。

1.3.3 脫色率測定

酶解液吸附前后在400 nm處的吸光度分別為OD400nm、OD′400nm，脫色率表示為 DE400nm。每個樣品測定 3次取平均值。

脫色率DE400nm（%）=（吸附前OD400－吸附后OD400）/吸附前 OD400×100

1.3.4 蛋白質損失率測定

酶解液在210 nm～220 nm有最大吸收峰，主要是由肽健產生的。測定酶解液吸附前后的吸光度OD220nm、OD′220nm，蛋白質損失率表示為LP220nm。每個樣品測定3次取平均值。

蛋白質損失率LP220nm（%）=（吸附前OD220－吸附后OD220）/吸附前 OD220×100

1.3.5 同時蒸餾萃取

取吸附前后的酶解液各100 mL，乙醚各60 mL，分別裝在兩個萃取瓶中，用電熱套加熱，乙醚溫度為49℃，酶解液保持微沸狀態(tài)，連接同時蒸餾萃取裝置連續(xù)萃取2 h。收集乙醚萃取液，加入適量的無水硫酸鈉，放入冰箱冷凍24 h后，過濾，濃縮至1 mL左右，貯于-18℃冰箱中，以備GC-MS分析。

1.3.6 GC-MS分析

氣相色譜條件：色譜柱Rtx-5 ms石英毛細管柱30 m×0.25 μm×0.25 mm；升溫程序：起始溫度 50℃，保持2 min，然后以5℃/min的升溫速度升溫到300℃，再以10℃/min的升溫速度升溫到320℃；進樣方式：手動（不分流）；進樣口溫度250℃；進樣量1 μL；載氣為 He；載氣流量 1.58 mL/min；分流比 12∶1。

質譜條件：離子源EI源；電子能量70 eV；離子源溫度為200℃；接口溫度為250℃。

1.3.7 分析方法

定性分析：把按以上步驟獲得的樣品置入GC-MS聯(lián)用儀進行分析鑒定，通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)檢索同時與NIST譜庫 （107k compounds）和 Wiley譜庫（320k Compounds，version 610）相匹配，僅列出匹配度大于80%的化合物，確認化合物成分。

定量分析：通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，按照面積歸一化法進行定量分析，分別求得各化學成分的相對含量。

2 結果與討論

2.1 吸附適宜條件的確定

根據(jù)單因素預實驗的結果（未列出），以pH、活性炭用量、溫度、時間為變量，以脫色率和蛋白質損失率為指標，進行U9（96）均勻試驗設計來優(yōu)化吸附條件，選擇出最佳優(yōu)化方案，試驗方案和結果見表1。

表1 U9（96）均勻試驗方案及結果Table 1 Even test plan and results

對表1的試驗結果進行全回歸分析，獲得關于蛋白質損失率（y1）、脫色率（y2）兩個回歸方程，蛋白質損失率（y1）方程在 α=0.20水平上呈顯著，脫色率（y2）方程在α=0.15水平上呈顯著。兩個回歸方程在一定程度上可以解釋試驗的結果。

本試驗目的是要求脫色率越大越好，蛋白質損失率越小越好，因此對兩個方程求其最大值或最小值時的最佳工藝條件，再綜合單因素水平影響分析，結果見表2。

表2 吸附的最佳工藝條件Table 2 Optimum parameters of adsorption

從表2可以看出，不同的試驗指標下最佳工藝條件是有所差異的，根據(jù)各工藝參數(shù)對結果的影響及綜合各指標的重要程度，首先是損失率，其次為脫色率，因此選擇吸附的工藝條件為pH6.0、活性炭用量0.85%、溫度50℃和時間55 min。在此條件下的進行模型預測和驗證試驗，結果見表3。

表3 驗證試驗結果Table 3 The testing results

從表3可以看出，蛋白質損失率和脫色率的模型預測值與試驗值時非常接近的，因此吸附的最佳工藝條件為pH6.0、活性炭用量0.85%、溫度50℃和時間55 min；在此條件下?lián)p失率為6.6%，脫色率為49.2%，且吸附后的酶解液與吸附前樣品相比，顏色呈淡黃色，色澤清澈，有輕微的魚腥味，苦味不明顯。

2.2 吸附對風味物質的影響

羅非魚下腳料蛋白酶解液主要由氨基酸、小分子多肽和核苷酸等呈味物質組成，其腥臭味來源于原料本身和水解過程，其形成的主要原因有[5]：（1）養(yǎng)殖環(huán)境的影響。魚飼料、水產動物食用的藻類、水質等條件對腥味物質的形成都有一定作用。Suffet等[6]研究了水體中對魚腥味形成有作用的物質，認為主要有己醛（hexanal）、庚醛（heptanal）、反-2，順-4-癸二烯醛（trans，cis-2，4-Decadienal）、反-2，順-4，順-7 癸三烯醛 （2-trans，4-cis，7-cis-decatrienal）、反-4-庚醛（trans，4-Hept-enal）及 1-戊烯-3 酮（1-penten-3-one）等物質。（2）在儲藏和處理的過程中，由于一些物理和機械作用，魚類體表會對體外的一些揮發(fā)性有機物化合物產生吸附，從而加重魚類本身固有的腥味。（3）魚類體中的物質發(fā)生生化反應，產生異味物質，如體內的脂肪酸自動氧化，會產生一些腥臭物質，一些多脂類魚在凍藏過程中會伴隨油燒的發(fā)生，使乙醛（ethanal）、丙醛（propanal）、丁醛（n-butylaldehyde）、戊醛（n-pentanal）等醛類顯著增加[7]，很多學者認為脂質氧化是造成魚類腥臭氣味加重的重要因素；魚表皮粘液和體內含有各種蛋白質，分解成肽和氨基酸后，在酶和微生物的作用下，進一步經過脫羧和脫氨反應生成有δ-氨基戊醛、δ-氨基戊酸和六羥基吡啶等腥味物質。

GC-MS分析活性炭吸附前后酶解液風味物質結果見圖1、2 和表4、5。

圖1 羅非魚下腳料酶解液GC-MS總離子流圖譜（吸附前）Fig.1 Ion chromatograph of Tilapia scraps enzymatic hydrolysate by GC-MS（before adsorption）

圖2 羅非魚下腳料酶解液GC-MS總離子流圖譜（吸附后）Fig.2 Ion chromatograph of Tilapia scraps enzymatic hydrolysate by GC-MS（after adsorption）

從表4、5中可以看出，檢測到的風味物質主要包括酯類、醛類、酮類、醇類、酸類、胺類和一些雜環(huán)類等，其中含量較多的有酯類、醛類和醇類。吸附前檢測到的風味物質主要種類按照相對含量比例依次為醛類、酯類、醇類、酮類、胺類、酸類。相對含量較高的醛類、酯類、醇類分別達到33.27%、23.1%、9.51%；吸附后檢測到的風味物質主要種類按照相對含量比例依次為酯類、醛類、酮類、醇類、酸類、胺類。相對含量較高的酯類、醛類、酮類分別達到26.19%、16.35%、6.95%。

通過表4、5對比可知，吸附前后，各類物質的相對含量均發(fā)生了變化。變化最為顯著的為醛類，吸附前后由33.27%降到16.35%，此外醇類由9.51%降到6.05%，胺類由3.76%降到2.03%；而酯類、酮類、酸類的相對含量都有提高，其中酯類由23.10%升到26.19%，酮類由4.26%升到6.95%，酸類由0.50%升到3.30%，因此可知活性炭對醇類、醛類和胺類的吸附能力較強。

表4 吸附前主要風味物質及含量Table 4 The main flavor substances and content before adsorption

表5 吸附后主要風味物質及含量Table 5 The main flavor substances and content after adsorption

綜合以上分析可知，羅非魚下腳料酶解液經活性炭吸附后，影響腥味嚴重的醛類、酮類和胺類明顯減小，此外一些研究證明腥味物質被吸附的同時一些苦味肽也被明顯吸附[8]，所以經過活性炭吸附以后腥苦味降低。

3 結論

通過均勻實驗設計對活性炭吸附羅非魚下腳料蛋白酶解液的工藝條件進行優(yōu)化，結果表明：在pH6.0、活性炭用量0.85%、溫度50℃、時間55 min的條件下吸附，蛋白質損失率為6.6%，脫色率為49.2%；且吸附后的酶解液顏色呈淡黃色，色澤清澈，有輕微的魚腥味，苦味不明顯，影響腥味嚴重的醛類、酮類和胺類明顯減小；由此吸附以后的酶解液外觀澄清透明，腥苦味較弱，易于被人們接受，這為羅非魚下腳料蛋白的有效利用提供了重要的理論依據(jù)。

[1]邸剛.關于我國羅非魚產業(yè)化發(fā)展的探討[J].中國漁業(yè)經濟，2002(4):17-18

[2]鄭桂富,徐振相.鰱魚蛋白水解液脫色效果的研究[J].食品工業(yè)科技,2002(9):25-27

[3]施文正,汪之和,林爭艷,等.白鰱魚蛋白水解液脫腥脫苦的研究[J].海洋水產研究,2004,25(3):28-32

[4]宋永相,孫謐,王海英,等.海洋活性膠原肽酶解液的脫色脫腥工藝[J].水產學報,2008,32(5):804-810

[5]王國超,李來好,郝淑賢,等.水產品腥味物質形成機理及相關檢測分析技術的研究進展[J].食品工業(yè)科技,2012,33(5):401-409

[6]Suffet I H,Khiari D,Bruchet A.The drinking water taste and odor wheel for the millennium：beyond geosmin and 2-methylisoborneol[J].Wat Sci Tech,1999,40(6):1-13

[7]沈月新,章超華,薛長湖,等.水產食品學[M].北京：中國農業(yè)出版社,2000：102-107

[8]楊蘭,白勇.蛋白質酶解產物苦味的形成及脫除的研究[J].廣州食品工業(yè)科技,2002,18(2):22-25