芒果葉不同極性部位提取物的抗氧化活性

劉剛，姜唯唯，吳京，張曉喻，*，范輝建，張宏

（1.四川師范大學生命科學學院，四川成都 610101；2.四川師范大學植物資源應用與開發研究所，四川成都610101；3.攀枝花市銳華農業開發有限責任公司，四川攀枝花 617000）

抗氧化活性與生物的抗病性、抗逆性及延緩衰老等密切相關[1]，常見的癌癥、動脈硬化、糖尿病、心血管病、老年癡呆、關節炎等疾病與自由基的作用相關[2-3]，機體適當補充外源性抗氧劑或給予能促使機體內源性抗氧化物恢復的藥物，可改善機體的正常功能[4]。

芒果（Mangifera indica L.）為漆樹科植物[5]，《中藥大辭典》記載：芒果葉味酸、甘，性涼，行氣疏滯，去痧積；治熱滯腹痛、氣脹；并洗爛瘡；提取物有抑菌及雌性激素樣作用[6]。現代臨床應用表明芒果葉具有平喘止咳、免疫、抗炎、抗脂質過氧化、抗腫瘤等作用[7-8]，國內外研究表明，芒果及其附屬物含有黃酮類、酚類等物質，而酚類物質具有高抗氧化活性及清除自由基等生物功能[9]。Sato[10]等研究芒果苷抗氧化活性的作用機理時發現，其具有快速清除DPPH的能力。Pitchaon[11]等對芒果核仁的抗氧化性進行了研究，認為芒果核仁總酚含量高，具有最強的清除自由基的能力，產品對皮膚無刺激，可用于食品、化妝品、保健品及藥物領域。Ajila[12]以芒果皮為原料進行研究，發現其提取物可抑制大豆卵磷脂氧化產物的生成，有較好的抗氧化活性。陳昱潔[13]等研究了芒果果核提取物的抗氧化活性。

目前，芒果葉提取物的抗氧化活性研究尚鮮見文獻報道，且未有對DPPH自由基抗氧化的反應條件進行考察與優化的報道。本研究以攀枝花凱特芒果葉為原料，用95%乙醇冷浸提取得到浸膏，再分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取浸膏，最后剩余的部分為水提部位。本實驗用DPPH法測定芒果葉各部位提取物清除自由基的能力，并對其反應條件進行考察，建立樣品最優反應方法，綜合評價其體外抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凱特芒果葉：攀枝花芒果基地，攀枝花市銳華農業開發有限責任公司；甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純：成都市科龍化工試劑廠；抗壞血酸（批號20120402）：成都市科龍化工試劑廠；芒果苷標準品、蘆丁標準品：四川省維克奇生物科技有限公司；DPPH：Sigma。

1.2 儀器與設備

UV-1700型紫外分光光度儀：SHIMADZU；Sartorius BP211D型電子天平：北京塞多利斯儀器系統有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；KQ5200E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HH.W21型恒溫水浴鍋：北京中興偉業儀器有限公司；BCD-518WS型冰箱：海爾集團。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液和DPPH溶液的制備

分別準確稱取VitC標準品、芒果苷標準品5 mg和DPPH粉末7.89mg，分別用甲醇溶解后定容至25mL，得0.2 mg/mL的VitC、芒果苷溶液以及2×10-4mol/L的DPPH溶液。溶液避光，4℃保存，現配現用。

1.3.2 芒果葉不同部位提取物溶液的制備

將自然風干的芒果葉粉碎至200目的粉末，以95%乙醇為提取劑，采用冷浸法提取出浸膏；將浸膏分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行依次萃取，每相萃取三次，每次萃取體積比為1∶1，合并萃取液，剩余部分為水部位，四組分別減壓干燥濃縮，分別得到芒果葉石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水部位提取物。精確稱取47.5 mg石油醚和35.7 mg乙酸乙酯的萃取物，用95%乙醇溶解后定容至25 mL，得濃度分別為1.90、1.43 mg/mL供試母液。再精確稱取43.0 mg正丁醇和44.2 mg水部位的提取物，用甲醇溶解后定容至25 mL，得濃度分別為1.72、1.77 mg/mL供試母液，避光低溫保存。

1.3.3 不同部位提取物黃酮含量的測定

1.3.3.1 標準曲線的繪制

稱取10.88 mg蘆丁標準品，用50%乙醇定容于50 mL 容量瓶中。分別移取標品母液 0.1、0.5、1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中，先各添加質量分數5%亞硝酸鈉水溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min；然后添加質量分數10%硝酸鋁水溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min；最后加入質量分數4%NaOH溶液4.00 mL，搖勻，用50%乙醇定容至刻度，靜置12 min，于510 nm處測定其吸光度，以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。得回歸方程：y=0.001 12x-0.004 81，R2=0.999 94。

1.3.3.2 黃酮含量的測定

精確稱取11.8 mg石油醚、10.5 mg乙酸乙酯萃取物，用95%乙醇溶解定容至10mL，再精確稱取12.8 mg正丁醇和13.2 mg水部位提取物，用甲醇溶解后定容至10 mL。分別精密移取不同部位提取物母液1 mL于10 mL容量瓶中，按照1.3.3.1方法在510 nm處測其吸光度值，以相應試劑為空白調零，用回歸方程計算出各極性部位的黃酮含量。

1.3.4 抗氧化測定條件的考察

1.3.4.1 測定波長的選擇

于190 nm～800 nm波長下，將DPPH溶液進行紫外吸收光譜掃描，結果在330、517 nm波長處有最大吸收，由于517 nm處DPPH有特殊吸收，因此選定測定波長為517 nm。

1.3.4.2 線性范圍的考察

分別精密吸取 DPPH 溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 和 5.0 mL，用甲醇稀釋至10 mL，搖勻，得不同濃度DPPH溶液，以甲醇為空白，在517nm波長處測定吸光度，每個濃度三個重復。得回歸方程：y=0.028 39x，R2=0.999 74。結果表明，DPPH溶液在0～41.400 mg/L的范圍內有良好的線性關系。

1.3.4.3 DPPH熱穩定性的考察

取2 mL DPPH溶液，加入甲醇2 mL，分別于20、30、40、50、60、70、80℃下避光水浴 30 min，測定其吸光度，每個溫度設3個重復，得到熱穩定性曲線圖。

1.3.4.4 抗氧化溫度的考察

準確量取石油醚、乙酸乙酯和正丁醇供試品母液1 mL定容至100 mL，搖勻，得稀釋100倍的樣品溶液；同樣方法配制水部分50倍的樣品溶液。取2 mL樣品溶液于試管中，加入2 mL DPPH溶液分別于20、30、40、50℃避光水浴反應30 min，于517 nm波長下測定吸光度（Ai）；分別精密吸取2 mL樣品溶液于試管中，加入2 mL甲醇（或95%乙醇）溶液，在相同條件下測定其吸光度（Aj）；Ac為不加樣品溶液的空白對照組。

1.3.4.5 抗氧化時間的考察

四個部分萃取物的樣品溶液配制方法同1.3.4.4，設置空白對照。每個實驗組重復三次，計算各樣品不同時間的清除率，分析最佳抗氧化時間。

1.3.5 清除DPPH自由基能力的測定

清除自由基的抗氧化劑能力采用清除DPPH的半數清除率，即IC50值來表示[14-15]。指將清除率（Y）對樣品濃度（X）作圖，求其對數函數方程，根據方程求出清除率為50%時藥物的濃度，即為IC50值。IC50值越小，表明其半數清除率越高，即抗氧化劑清除自由基的能力越強[16]。

選擇考察結果中抗氧化能力最佳的溫度及時間，確定最佳方法，將供試品母液及對照品配制成不同濃度梯度，于517 nm下測定吸光度值。每個實驗重復三次。按下列公式計算自由基的清除率：

式中：Ai為2 mL樣品液+2 mL DPPH液，混合后的吸光度值；Aj為2mL樣品液+2mL溶劑，混合后的吸光度值；Ac為2 mL DPPH液+2 mL溶劑，混合后的吸光度值。

1.3.6 實驗設計與統計分析

按芒果葉提取部位的不同設置五個樣品溶液組，同時設定“樣品溶液-溶劑”和“DPPH溶液-溶劑”空白對照組兩個。測得吸光度后，按公式計算各樣品組的自由基清除率，依據各樣品組的清除率、各樣品組溶液質量濃度的梯度變化關系。用SPSS17.0中PROBIT方法進行分析，計算得到各樣品組的IC50值。

2 結果與分析

2.1 芒果葉不同極性部位黃酮含量

按照1.3.3.1方法分別測定石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水等部位的提取物，以相應溶劑為空白，計算出各極性部位的黃酮含量，見圖1。

圖1 芒果葉不同極性部位提取物的黃酮含量Fig.1 Flavonoid content of different polarity fractions of extracts from mango leaves

由圖1可以看出，芒果葉不同極性部位提取物中黃酮含量具有較大的差異。含量最高的是乙酸乙酯部位，為（292.063±1.100）mg/g；含量最低的是水部位，為（21.717±1.157）mg/g。黃酮含量大小順序為乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位＞水部位。

2.2 測定方法的考察

由于DPPH自由基會受到時間和溫度的影響，但其在一定條件下是相對穩定的。所以對DPPH熱穩定性，以及樣品抗氧化溫度和時間進行考察，以得到DPPH穩定反應的溫度范圍，建立樣品最優反應方法。

2.2.1 DPPH的熱穩定性

不同溫度下避光水浴30 min后，分別測定DPPH溶液的吸光度，得出其熱穩定性曲線，見圖2。

圖2 不同溫度下DPPH溶液的熱穩定性Fig.2 The thermal stability of the DPPH in different temperatures

從圖2可以看出，DPPH溶液在20℃～50℃范圍內較為穩定，對應的濃度平均為：（30.007±0.169）mg/L。而60℃～80℃明顯下降，濃度平均值從（27.627±0.008）mg/L降到（22.222±0.563）mg/L。表明DPPH溶液在20℃～50℃范圍較穩定，故將測試的溫度設定在此范圍。

2.2.2 測定的溫度

按照1.3.4.4項的方法，得出不同樣品溶液在20℃～50℃的清除率，見圖3。

圖3 芒果葉不同極性部位提取物在不同溫度下的清除率Fig.3 The scavenging percentage of different polarity fractions of extracts from mango leaves in different temperatures

由圖3可以看出，芒果葉石油醚和乙酸乙酯萃取物在20℃～50℃范圍內對DPPH自由基清除率，均在50℃時清除率最高。所以選擇50℃為兩部分萃取物反應最佳溫度。芒果葉正丁醇萃取物此范圍內清除率相差不大，其中30℃時清除率為最高，可選擇30℃為此部分萃取物反應溫度；芒果葉水部位在40℃時清除率為最高，所以此部分反應的溫度選擇40℃。

在DPPH熱穩定范圍內，石油醚和乙酸乙酯萃取物對DPPH的清除能力均隨著溫度的升高而增加，正丁醇和水部位提取物達到最高值后略微有所下降，但相差不大。

2.2.3 反應的時間

不同樣品溶液于較好的反應溫度條件下，不同反應時間的清除率，結果見圖4。

圖4 芒果葉不同極性部位提取物在不同時間下的清除率Fig.4 The scavenging percentage of different polarity fractions of extracts from mango leaves in different times

從圖4可以看出，芒果葉石油醚、正丁醇萃取物以及水部位提取物在各自最佳反應溫度下均以20 min時的樣品清除率最高，所以選擇20 min為此三種提取物的最佳反應時間；而乙酸乙酯萃取物的最佳反應時間為30 min。

2.3 芒果葉提取物清除DPPH自由基的能力

根據已經確定的反應溫度、時間，對芒果葉的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位提取物進行DPPH自由基清除率的測定，并與芒果苷、抗壞血酸標準品進行比較，結果見圖5。

圖5 芒果葉不同極性部位提取物對DPPH的清除能力Fig.5 The scavenging activities of different polarity fractions of extracts from mango leaves towards DPPH feel radical

從圖5可知，芒果葉四種不同極性部位的提取物對DPPH自由基均具有一定清除能力，且隨著樣品溶液質量濃度的增加，清除率也隨之增強，當清除率達到90%以上后，各提取物的清除率增長減緩，表明樣品與DPPH反應達到飽和。其中乙酸乙酯、正丁醇萃取物與芒果苷、VitC標品的清除率相當。

由于各樣品溶液及標準品溶液濃度與清除率間并不呈線性關系，所以使用SPSS17.0的PROBIT方法進行回歸分析。得到方程：PROBIT（P）=Intercept+BX，模型擬合優度經過卡方檢驗，再從PROBIT分析的結果中查得IC50值（即Prob=0.50時的樣品濃度），及其95%置信區間，結果見表1。

表1 芒果葉不同極性部位提取物及對照品的IC50值Table 1 The IC50values of different polarity fractions of extracts from mango leaves and reference substance

結果表明，芒果葉的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物及水部位提取物的IC50值分別為：102.877、9.014、19.494、221.784 μg/mL。IC50值越小，表明清除 DPPH 自由基的能力越強，從試驗結果可以看出：芒果葉不同極性部位提取物抗氧化活性的順序，乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位＞水部位。乙酸乙酯提取物的IC50值與對照標品芒果苷及VitC的相當。

2.4 芒果葉不同極性部位提取物黃酮含量與抗氧化活性的相關性

使用SPSS17.0軟件對芒果葉各部位提取物的黃酮含量與其清除DPPH自由基的IC50值進行相關性分析，結果顯示黃酮含量與IC50值的相關系數為-0.872（P=0.000），表明黃酮含量越高其IC50值越小。以“提取劑的種類”為協變量的情況下，黃酮含量與IC50值的偏相關系數為-0.945（P=0.000），說明考慮不同極性的提取劑對抗氧化活性的影響后，兩者間的相關系數變大。同時，“提取劑的種類”與IC50值的Spearman相關系數為0.482，“提取劑的種類”對IC50值的影響較小，所以可以認為黃酮含量是影響IC50值的主要因素，即芒果葉不同極性提取物的抗氧化活性的變化，主要受到其黃酮類物質含量高低的影響。

3 結論

本研究以攀枝花凱特芒果葉為原料，用95%乙醇冷浸提取后再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，分別得到三個組分，最后的剩余部分為水部位。用DPPH法綜合評價芒果葉不同部位提取物的抗氧化活性，以IC50值作為評價清除DPPH自由基能力的指標，用芒果苷和抗壞血酸作為對照品進行自由基清除率的比較。試驗結果表明芒果葉不同極性部位提取物均具有一定的抗氧化活性，其中乙酸乙酯萃取物抗氧化活性最強，其次依次為正丁醇、石油醚、水部位提取物。分析結果表明，芒果葉各極性部位提取物的黃酮含量與清除DPPH自由基的能力呈負相關，芒果葉各部位提取物的黃酮含量是影響其抗氧化活性的主要因素。

本試驗初次對芒果葉的抗氧化活性進行測定分析，且首次對抗氧化的反應條件進行考察與優化，結果發現其乙酸乙酯萃取物具有很高的抗氧化活性，與芒果苷及抗壞血酸標品相當。由于芒果樹每年會有枝葉修剪以及大量落葉，收集方便且目前沒有對其進行利用，所以充分利用芒果葉，將芒果葉提取物用于抗氧化活性用途的開發，可以避免資源的浪費、提高芒果的綜合開發價值。但其各部位提取物的化學成分及其具體抗氧化機制尚未明確，有待進一步深入研究。

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