超聲波輔助酶法提取碎米中蛋白的研究

朱建華，鐘瑞敏，鄒秀容

（韶關學院英東食品科學與工程學院，廣東韶關512005）

稻米是我國居民特別是南方地區居民最主要的食物來源。我國每年生產約1.85億t稻谷。稻谷碾制過程和優質大米的生產中，不同程度產生約10%～35%左右的碎米[1-2]。大米加工精度的不斷提高，產品分級整理逐步加強，產生的碎米也越來越多。碎米的價格僅為整米的1/3～1/2，而其化學組成與大米相同。碎米含有80%的優質大米淀粉及8%的大米蛋白，其中大米蛋白是人們膳食中重要的蛋白來源，其必需氨基酸構成比較完整，與WHO/FAO推薦的理想營養模式非常接近[3]。在谷物蛋白中，大米蛋白含有較高的賴氨酸，不含任何抗營養因子，具有良好的消化性和高的營養價值。因此大米蛋白的開發利用日益受到重視。

超聲波處理指利用功率超聲波調制體系中的物理或化學反應作用，因可以在液態體系中產生空化、剪切、劇烈攪拌等作用而具突出的分散效應，可為實現將目標物質分散到液態體系的過程提供一種高效分散的物理場環境[4]。因此超聲技術已被廣泛用于各種植物蛋白的提取富集過程，但迄今為止鮮見應用超聲技術提取碎米蛋白的研究[5]。碎米中蛋白與淀粉絡合緊密，淀粉酶酶解淀粉網絡可促進蛋白的釋放[6]。因此本文采用超聲物理解聚輔助高溫淀粉酶法分離提取碎米中的蛋白，主要選取加酶量、酶解時間、超聲處理時間、超聲處理功率、固液比作為單因素條件進行試驗，考察單因素對提取率的影響趨勢，進而通過正交實驗優化得出超聲輔助酶法提取碎米蛋白的最優工藝條件，研究結果以期為后續稻谷加工業副產物碎米的精深加工提供一定的參考作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑及儀器設備

碎米：廣東金友集團有限公司提供，蛋白含量為8.32%；高溫 α-淀粉酶（20 000 U/mL）；江蘇銳陽生物有限公司。主要儀器設備有SCIENTZ-Ⅱ（950W）超聲波細胞粉碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；pHS-25型酸度計：上海精密科學儀器有限公司；HHS28S型恒溫水浴鍋：金壇恒豐儀器廠；722型紫外可見分光光度計：上海佑科儀器儀表；JB90-H型磁力攪拌機：上海精密電子儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原材料的處理

將碎米置烘箱中干燥后粉碎，過60目篩，裝入保鮮袋中密封備用。

1.2.2 蛋白質的提取

稱取相應量的米粉于容量器皿中，根據試驗條件添加高溫α-淀粉酶，然后加蒸餾水（或自來水）溶解，置于水浴鍋中恒溫水解再放在超聲儀中處理，將超聲探頭浸入配制好的米粉懸浮液液面以下2 cm，超聲探頭與盛放樣品的燒杯同軸放置并位于液面中間，同時將盛放樣品的燒杯置于冰水浴中（如圖1），超聲處理處理全過程按超聲0.8 s，暫停1.2 s模式進行，以避免樣品因連續超聲作用而使溫度驟升，導致樣液中淀粉糊化影響蛋白提取過程的進行。按預設超聲處理條件處理完畢后冷卻至室溫，然后離心，取上清液進行考馬氏亮藍染色處理，置于722型分光光度計進行測量，測出碎米中蛋白質含量。

圖1 超聲處理裝置示意圖Fig.1 Schematic of experimental apparatus

1.2.3 標準蛋白質曲線的測定

碎米粉中蛋白質含量：用凱氏定氮法測定，參照GB5009.5-85《食品中蛋白質的測定方法》。上清液中蛋白質含量，以牛血清蛋白為標準，用考馬氏亮藍法測定。標準曲線中以吸光度（y）為縱坐標，以牛血清白蛋白質量為橫坐標（x），見圖2。得到如下回歸方程：y=0.004 2x-0.320 1，相關系數平方值R2=0.997 9。

1.2.4 蛋白質提取率及純度的計算

大米蛋白提取率（%）=上清液蛋白質克數/原料中蛋白質克數×100%

圖2 牛血清白蛋白的標準曲線Fig.2 Standard curve of bovine serum albumin

1.2.5 超聲波提取碎米蛋白的工藝流程

稱取適量米粉→調配固液比→加酶按設定時間進行水解→設定超聲時間、超聲功率→超聲處理→離心→取上層清液→稀釋→考馬斯亮藍染色→測定吸光度

2 結果與討論

2.1 高溫α-淀粉酶加酶量對碎米蛋白質提取的影響

在提取溫度90℃，自然pH，酶解反應時間為1 h，加入高溫α-淀粉酶，固液比為1∶20的條件下，選擇不同加酶體積量與碎米粉質量梯度比 0、5、10、15、20、25 μL/g進行酶解處理提取，測定其蛋白提取率，結果見圖3。

圖3 加酶量對蛋白質提取率的影響Fig.3 The effect of enzyme amount on protein extraction yield

由圖3可以知，隨著加酶量的增加，蛋白提取率顯著上升，這可能是因為在加酶量低時，酶能夠全部參與反應，處于酶反應動力學一級階段，上升速度快，但高于20 μL/g后，提取率增加的速度減慢。

2.2 高溫α-淀粉酶酶解時間對碎米蛋白質提取的影響

加入高溫α-淀粉酶15 μL/g，提取溫度90℃，自然pH，固液比為1∶20的條件下，選擇不同酶解時間0、30、45、60、75、90 min 進行提取，測定其蛋白提取率，結果見圖4。

圖4 酶解時間對蛋白質提取的影響Fig.4 The effect of enzymlatic time on protein extraction yield

由圖4可知，加入高溫α-淀粉酶后大米蛋白提取率隨著時間的延長而增加，其原因是此時未被淀粉水解的底物較多，即酶促反應中的底物濃度相對較高，但隨著時間的進一步延長，30 min后蛋白提取率不再有明顯提高。

2.3 超聲時間對碎米蛋白提取的影響

固液比調配為 1∶10（g/mL），攪拌均勻，然后將樣品液置于超聲儀中，分別采用超聲時間4、8、12、16、20、24、28、32 min，在超聲功率為475 W下超聲處理，實驗結果見圖5。

圖5 超聲時間對碎米蛋白提取率的影響Fig.5 The effect of sonication time on protein extraction yield

由圖5可知，超聲提取時間對碎米蛋白提取有一定的影響，隨著時間的延長，蛋白的提取率顯著增加，主要是因為隨著超聲時間的延長，超聲波對底物產生的攪拌及空化作用增強，進而導致與淀粉結合緊密的蛋白從淀粉蛋白絡合物中分理出的結果，在超聲處理28 min的時候達到最大，之后隨超聲處理時間延長上清液中蛋白提取率呈現下降的趨勢。可能是由于超聲提取時間過長，超聲波引起產物結構變化，導致提取率的降低。

2.4 超聲功率對碎米蛋白提取的影響

稱取由碎米制成的60目的米粉1.5 g，經固液比為1∶10（g/mL）的樣品預處理，將樣品液置于超聲儀中進行處理，分別采用超聲功率 285、380、475、570、665W，超聲處理20 min，結果見圖6。

圖6 超聲功率對碎米蛋白提取的影響Fig.6 The effect of sonication power on protein extraction yield

通常，超聲功率越高，越容易獲得較大的振動剪切和空化能量，由圖7可知，隨超聲功率的增大，超聲波的提取作用增強，上清液中蛋白提取率隨超聲處理功率增加而增加，超聲功率在570 W時，提取率達最大值，隨后進一步增加超聲功率，提取率反而呈現下降趨勢，主要是因為溫度過高導致米粉糊化，無法離心所致。

2.5 固液比對碎米蛋白提取的影響

固定超聲時間20 min、功率475 W，目數60目，研究不同的固液比對蛋白提取率的影響。由圖7可知，隨著固液比的增大，蛋白質的提取率逐漸上升。當固液比超過1∶20時，蛋白質提取率增幅不明顯，加水量的多少直接影響了超聲處理的效果。是因為加水量的多少直接影響了超聲能量在提取液中的分布密度。同時由于大米胚乳內部蛋白質與淀粉顆粒的包絡結合緊密，適當的固液比可使超聲能量擴散進入淀粉內部，將大分子的大米蛋白降解、修飾，使其變得可溶，從而達到分離的目的。因此，固液比取1∶20左右。

圖7 固液比對蛋白提取率的影響Fig.7 The effect of solid liquid ratio on protein extraction yield

2.6 超聲輔助高溫α-淀粉酶提取碎米蛋白質的預實驗

稱取1.5 g碎米粉，添加固液比為1∶20的自來水，加酶量20 μL/g，酶解時間30 min，超聲時間為20 min，超聲功率為475 W，結果見圖8。

圖8 超聲與酶解順序對蛋白提取率的影響Fig.8 The effect of procedure between sonication and enzymatic on protein extraction yield

由圖8可知，未經酶處理和超聲處理的對照樣提取率最低。先超聲波處理再加高溫α-淀粉酶水解提取率較低，可能是由于隨著超聲時間的延長，蛋白質體系受超聲處理后分散均勻和大米分離蛋白亞基伸展形成弱凝膠網格，不利于酶解的繼續進行。酶法屬于生物性方法，高溫α-淀粉酶將大米淀粉降解為更易溶解的糊精和低聚糖，繼而轉化為更多的水溶性小分子活性膚和游離氨基酸，而且由于還沒被降解的底物經超聲處理后，蛋白質的三級結構破壞較完全，有利于酶解的進行，所以提取率較其他三種方法要高。由圖8看出，綜合各種條件可知，提取碎米蛋白質的最佳處理方案是先加高溫α-淀粉酶對樣品進行水解后再進行超聲波處理。

2.7 正交試驗及結果分析

在單因素試驗的基礎上，為了進一步研究不同條件對蛋白質提取率的影響和確定最佳工藝，我們根據以上的單因素試驗選擇對提取率影響較大的高溫α-淀粉酶加酶量、酶解時間、超聲時間、超聲功率4個因素擬水平，列表，采用L9（34）正交表進行試驗，以蛋白質提取率（%）為指標，結果見表2。

從極差分析結果可以看出，各因素對蛋白質提取率影響的大小次序是：A﹥D﹥B＞C，相比之下，高溫α-淀粉酶加酶量對提取率影響最大，其次依次為是超聲時間、酶解時間和超聲功率；以蛋白質提取率為指標可能最好的理論優化方案為A1B3C3D1，即高溫α-淀粉酶加酶量為10μL/g，酶解時間為2.5h，超聲時間為24min，超聲功率為475 W，固液比為1∶20。可見，高溫α-淀粉酶加酶量對碎米蛋白質的提取有著重要的影響，超聲波處理時間對碎米中水溶性蛋白質的溶解也有著不可忽視的影響。隨著酶解時間和超聲功率的變化，蛋白質提取率也發生相應的變化，因此進一步進行驗證。正交表中并沒有A1B3C3D1這個優化方案，但正交表中以方案9（A3B3C2D1）的提取率最高。為驗證最佳工藝參數，對最優方案與正交表中方案9在相同試驗條件下進行對比，經驗證得理論優化方案的蛋白質提取率為79.96%，低于方案9的91.19%，因此，方案9的提取率更高，即先高溫α-淀粉酶水解再超聲波處理提取碎米蛋白質的最佳工藝條件是高溫α-淀粉酶加酶量為20 μL/g、酶解時間為2.5 h、超聲時間為24 min，超聲功率為380 W。

表1 正交試驗水平表Table 1 The levels of orthogonal test

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal test

3 結論

實驗結果表明最佳提取條件為：高溫α-淀粉酶加酶量為20 μL/g、酶解時間為2.5 h、超聲時間為24 min，超聲功率為380 W，該條件下碎米蛋白提取率可達91.19%。超聲輔助酶法從碎米中提取蛋白成分的效果好，成本低，對稻谷加工業副產物碎米的精深加工有一定的參考作用。

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