壺瓶棗提取物抗氧化性研究

李海平，陳冬梅，吳蓉蓉，王迎進

（忻州師范學院化學系，山西忻州034000）

壺瓶棗（Zizyphusjujuba cv.Huping）為鼠李科（Rhamnaceae）棗屬植物果實。壺瓶棗個大、皮簿、肉厚，風味甘美，有“八個一尺，十個一斤”之美稱，在國內外享有盛譽，主要產于山西太谷、榆次、交城、清徐等地。壺瓶棗是一種滋補佳品，中醫認為有補中益氣，養血安神，生津液，潤心肺，補五臟，治虛損及解毒等功效，在產區有“每日三顆壺瓶棗，身體強健不服老”的說法。近年來，國內文獻報道了對壺瓶棗的初步研究，多集中在壺瓶棗的防裂、栽培及儲藏技術[1-2]；另外，侯天宇研究了壺瓶棗中蘆丁的超聲波法提取工藝[3]；王愈研究了壺瓶棗汁浸提和澄清工藝[4]；而關于壺瓶棗提取抗氧化性的相關研究卻鮮見報道。鑒于壺瓶棗藥食兩用的對重功效，本實驗探討了壺瓶棗提取物的抗氧化性，為進一步揭示壺瓶棗的生物活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壺瓶棗：購于山西忻州農貿市場；蘆丁標準品、菲洛嗪、DPPH：購于Sigma公司，其他試劑，均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 壺瓶棗的提取

將壺瓶棗去核，干燥，粉碎，過60目篩。取50 g置于圓底燒瓶中加入500 mL乙醚，回流提取2 h以脫脂，抽濾，然后再加入500 mL石油醚，回流提取2 h脫色，抽濾。濾渣通風干燥得壺瓶棗棗粉。

水提取物：稱取脫脂脫色壺瓶棗粉5 g，料液比為1∶20（g/mL），在溫度60℃、功率240 W條件下超聲30 min，取上清液。同樣方法重復提取一次，合并濾液得壺瓶棗水提取物。

醇提取物：以無水乙醇代替二次蒸餾水按上述方法得醇提取物。

1.2.2 提取物的定性實驗

1.2.2.1 顯色反應

取0.01 g/mL FeCl3溶液，向待測液中滴加該溶液，觀察顏色變化。配制0.02 g/mL FeCl3溶液和0.01 g/mL鐵氰化鉀溶液，等體積混合，向待測液中滴加該溶液，觀察顏色變化；加入HCl溶液，觀察顏色變化。配制0.01 g/mL AlCl3溶液，向待測液中滴加該溶液，觀察顏色變化[5]。

1.2.2.2 提取物黃酮類化合物含量的測定

準確稱取蘆丁標準品11.7 mg，用70%的乙醇定容至 50 mL 容量瓶中。分別取 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于8個10 mL比色管中，用70%乙醇補充至 5 mL，加入 0.3 mL 0.05 g/mL NaNO2，搖勻，放置6 min后加入0.3 mL 0.1g/mL Al（NO3）3，搖勻，6 min后加入4 mL 0.04 g/mL的NaOH，混勻，用70%乙醇定容，10 min后于510 nm波長處測定吸光度（A）值。得標準曲線方程：y=0.011 3x+0.004 5（R2=0.997 1）。

1.2.3 壺瓶棗提取物的抗氧化性

1.2.3.1 羥自由基清除率的測定參考文獻[6]

量取2.0 mLPBS磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.4，下同）和4.0 mL蒸餾水于10 mL比色管中，定容作空白參比管；量取 2.0 mLPBS，1.0 mL 鄰二氮菲（1.5 mmol/L，下同）、1.0 mLFeSO4（1.5 mmol/L，下同）和 2.0 mL蒸餾水于10 mL比色管中，混勻作未損傷管；量取2.0mL PBS，1.0 mL 鄰二氮菲，1.0 mL FeSO4，1.0 mL 蒸餾水和1.0 mL H2O2（0.02%）于 10 mL 比色管中，作損傷管；量取2.0 mLPBS，1.0 mL樣品液和3.0 mL蒸餾水于10 mL比色管中，作樣品參比管；量取2.0 mLPBS，1.0 mL鄰二氮菲，1.0 mLFeSO4，1.0 mL壺瓶棗試樣液和1.0 mL H2O2于10 mL比色管中，定容作樣品管。將上述試管置于恒溫水浴鍋中，37℃保溫60 min，于波長536 nm處測吸光度（A）值，每種處理平行3次，用其平均值按下式計算羥自由基清除率（%）。以VC作對照。

1.2.3.2 超氧陰離子自由基清除率的測定參考文獻[7]

采用鄰苯三酚自氧化法，量取Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL向其中加入1.0 mL鄰苯三酚（7 mmol/L）并開始計時，定容到10 mL，于325 nm處測得反應體系的吸光值A0。按照上述方法，量取4.5 mLTris-HCl緩沖溶液和1 mL藥液，在室溫下放置4 min，立即加入1 mL鄰苯三酚并開始計時，定容到10 mL，于325 nm處每隔30 s測定反應體系的吸光值Ai，共記錄前4 min；實驗平行3次，求其平均值。按下式計算超氧陰離子自由基清除率（%）。以VC作對照。

1.2.3.3 DPPH·清除率的測定參考文獻[8]

量取2.0 mL藥液及2.0 mL濃度為2×10-4mol/L的DPPH·溶液于10 mL比色管，30 min后以試樣提取溶劑為空白調零于517 nm處測定其吸光度Ai；測定2.0 mL濃度為2×10-4mol/L的DPPH·溶液與2.0 mL 70%乙醇混合液的吸光度Ac；再測定2 mL壺瓶棗提取液與2.0 mL無水乙醇混合液的吸光度Aj；平行測定3次，求其平均值。根據下列公式計算壺瓶棗提取液對DPPH·的抑制率（%）。以VC作對照。

1.2.3.4 還原性測定參考文獻[9]

移取壺瓶棗提取物，稀釋成一定濃度的溶液，取1 mL不同濃度梯度的各樣品，加入2.5 mL 0.01 g/mL K3Fe（CN）6，2.5 mL 0.2 mol/L，pH=6.6 的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻，于50℃反應20 min。取出再加入2.5 mL 0.1 g/mL三氯乙酸。離心10 min，取上層溶液5.0 mL加入蒸餾水5.0 mL，0.1 g/100 mL FeCl31.0 mL，用分光光度計于700 nm波長處測定吸光度。

1.2.3.5 金屬螯合能力的測定參考文獻[10]

取不同濃度的樣品溶液1.0 mL于試管中，分別加入0.05 mL 2 mmol/L的FeCl2溶液、0.2 mL 5 mmol/L的菲洛嗪溶液和2.75mL蒸餾水，混勻，10min后于562nm波長處測定吸光度。同時做樣品空白實驗（以水代替FeCl2溶液）。以水代替樣液和FeCl2溶液，做參比實驗調零。所有測定值均為3次平均值。混合體系中Ferrozine-Fe2+抑制率計算如下。

式中：A0為水代替樣液時的吸光度值；A1為樣品的吸光度值；A2為樣品空白的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 顯色反應

壺瓶棗提取物的顯色實驗結果如表1所示。

表1 壺瓶棗提取物顯色反應Table 1 Phenomena of color reaction for extracts from Zizyphus jujube cv.Huping

由表1可知，特定顏色反應表明壺瓶棗水提取物和乙醇提取物中均含有黃酮類化合物。

2.2 壺瓶棗提取物中黃酮類化合物含量測定

壺瓶棗水提物中黃酮類物質含量為2.86 mg/g，醇提物黃酮類物質含量為6.57 mg/g。

2.3 對羥自由基清除率的測定

羥自由基清除率是反映藥物抗氧化作用的重要指標。壺瓶棗提取物和VC對羥自由基的清除效果見圖1。

由圖1可知，在較低濃度范圍內，壺瓶棗提取物就具有較強的羥自由基清除能力，且隨著質量濃度的增大，其羥自由基清除能力也隨之增強。壺瓶棗提取物清除羥自由基能力為：壺瓶棗乙醇提取物IC50為60.03 μg/mL，水提取物 IC50為 61.04 μg/mL，稍高于 VC 70.31 μg/mL。

圖1 壺瓶棗提取物對HO·的清除作用Fig.1 The HO·scavenging capacity of extracts from Zizyphus jujube cv.Huping

2.4 對超氧陰離子自由基清除率的測定

壺瓶棗提取物和VC對超氧陰離子自由基的清除效果見圖2。

圖2 壺瓶棗提取物對O2-·自由基的清除作用Fig.2 The O2-·scavenging capacity of extracts from Zizyphus jujube cv.Huping

由圖2可知，壺瓶棗提取物清除超氧陰離子自由基能力高于VC（IC5022.03 μg/mL），且隨著質量濃度的增大，對超氧陰離子自由基清除能力也隨之增強。壺瓶棗水提取物IC50為1.80 μg/mL，乙醇提取物IC50為1.70 μg/mL。

2.5 對DPPH·自由基清除率的測定

壺瓶棗提取物和VC對DPPH·的清除效果見圖3。

由圖3可知，壺瓶棗提取物對DPPH·的清除能力與質量濃度呈正相關。壺瓶棗提取物對DPPH·自由基清除能力依次為：壺瓶棗乙醇提取物IC50為0.58μg/mL，壺瓶棗水提取物 IC50為 4.13 μg/mL，VC的IC50為 0.57 μg/mL。

2.6 還原性測定

物質的還原能力可以看作其潛在抗氧化性的重要體現。壺瓶棗提取物和VC的還原能力效果見圖4。

圖3 壺瓶棗提取物對DPPH·的清除作用Fig.3 The DPPH·scavenging capacity of extracts from Zizyphus jujube cv.Huping

圖4 壺瓶棗提取物還原性測定Fig.4 The reducing power of extracts from Zizyphus jujube cv.Huping

由圖4可知，在較低濃度范圍內，壺瓶棗提取物均表現出一定還原能力，且隨著濃度的增大，其還原能力也逐漸增強。壺瓶棗提取物的還原能力為：VC＞醇提取物＞水提取物。

2.7 金屬螯合能力測定

壺瓶棗提取物金屬螯合能力效果如圖5所示。

圖5 壺瓶棗提取物金屬螯合能力測定Fig.5 The ferrous iron chelating capacity of extracts from Zizyphus jujube cv.Huping

由圖5可知，壺瓶棗水提取物和醇提取物均具有金屬螯和能力，且金屬螯合能力與質量濃度呈正相關。水提取物的IC50為426.02 μg/mL，而醇提取物的IC50為36.67 μg/mL，遠遠高于水提取物的金屬螯合能力。

3 結論

實驗證明：壺瓶棗提取物均具有清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的能力及金屬螯合能力和還原能力。壺瓶棗水提取物的抗氧化能力為：超氧陰離子自由基（IC501.80 μg/mL）＞DPPH·自由基（IC504.13 μg/mL）＞羥自由基（IC5061.04 μg/mL）。而醇提取物的抗氧化能力為：DPPH·自由基（IC500.58 μg/mL）＞超氧陰離子自由基（IC501.70 μg/mL）＞羥自由基（IC5060.03 μg/mL）。醇提物的金屬螯合能力和還原能力均高于水提物。

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