響應面法優化靈芝子實體三萜提取工藝的研究

洪文龍，童斌，趙格

（江蘇農林職業技術學院，江蘇 鎮江212400）

1982年Kubora.T等首次從赤芝子實體中分離得到三萜類化合物。靈芝三萜是一個大的統稱，又稱為靈芝三萜類或總三萜[1]。三萜類（Trierponoides），以四環三萜化合物為主，具有抗癌、促進肝功能、抗過敏、抗炎止痛之功效。靈芝中三萜含量很高，而其它藥用植物含量則很少。其他植物中也含有三萜類，但是靈芝所含有的特殊三萜類（或稱“靈芝酸”），為其他植物所沒有[2]。三萜類靈芝酸為保護肝功能的主要成分，具有強烈的藥理活性，有護肝、解毒和止痛等功能。如靈芝酸A、B、C和D能抑制細胞組織胺的釋放，靈芝酸F有很強烈的抑制血管緊張素酶的活性，靈芝酸R和S有強烈的抗病毒能力[3]。

試驗通過有機溶劑加以超聲波輔助提取的方法研究了靈芝子實體三萜的提取方法，采用超聲提取工藝，縮短了提取時間、降低了提取溫度，其原因是超聲波產生的強烈振動、高的加速度、強烈的空化效應、攪拌作用等，都可加速有效成分進入溶劑，從而提高了提出率，縮短了提取時間，并且免去了高溫對提取成分的影響，對傳統的提取手段有了較大改進[4]。

1 材料與設備

1.1 材料

赤靈芝純子實體超細粉：上海市農業科學院上海菇寶食用菌有限公司；標準齊墩果酸：上海金穗生物科技有限公司（≥98%）；95%乙醇、5%香草醛-冰乙酸、高氯酸、冰醋酸等：上海國藥試劑公司，為分析純。

1.2 設備

G＆G/雙杰JJ224BC型電子天平：UV-2100型紫外可見分光光度計；KQ3200 E型超聲波清洗器；HHS型電熱恒溫水浴鍋。

2 原理和操作方法

2.1 原理

三萜類物質溶于有機溶劑，加入5%香草醛－冰醋酸溶液和高氯酸混勻，用三萜類化合物在加熱的條件下可以和香草醛－高氯酸試劑發生顯色反應，在550 nm處有最大吸光度，根據繪制的標準曲線計算三萜含量。

2.2 靈芝三萜提取過程

齊墩果酸標準曲線的繪制→樣品超聲提取→過濾后棄初濾液→分光光度法測吸光度→根據標準曲線方程計算三萜提取率。

2.3 齊敦果酸標準曲線的繪制

精確稱取齊墩果酸標準樣品17 mg，置100 mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度。分別吸取標準溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于試管中，另取 0 號試管加入無水乙醇1 mL，將所有試管置于沸水浴中揮去溶劑，加5%香草醛-冰乙酸0.3 mL，高氯酸1.0 mL，迅速用混合儀混均溶液。再將試管置于70℃水浴中加熱15 min，拿出用冰水冷卻至室溫，冰醋酸定容至10 mL，迅速混勻溶液，在550 nm處測定吸光值，以吸光度為縱坐標，以齊墩果酸微克數為橫坐標作標準曲線，根據齊墩果酸的含量（μg）和吸光值（A）的關系，建立線性回歸方程[5]，見圖1。

圖1 齊墩果酸標準曲線Fig.1 Oleanolic acid standard curve

建立線性回歸方程：Y=0.055 X-0.009 4，R2=0.999 3。

2.4 樣品靈芝三萜得率測定

準確稱取一定量1.0 g樣品，加乙醇進行超聲處理，樣液加乙醇定容至100 mL，搖勻，過濾，棄去初濾液，收集濾液，吸1 mL濾液于試管中，參比管加1 mL無水乙醇。用測定標準工作曲線的方法，測定樣品在550 nm處測定吸光值，根據標準曲線計算出相應的三萜含量，根據公式計算樣品三萜含量。

3 結果與分析

3.1 單因素變量試驗

實驗選擇95%乙醇、超聲頻率（50 Hz）為定量，檢測含量試驗條件一致[6]。以超聲溫度、時間、料液比為變量進行單因素試驗，驗證分析各個單因素變量對提取率的影響及相互關系。

3.1.1 不同超聲時間對三萜化合物提取率的影響

稱取1.0 g的靈芝粉5份，分別于100 mL容量瓶中，按料液比1∶20分別加人95%，在60℃條件下，超聲頻率 50 Hz，提取時間分別為 30、40、50、60 min。提取后，樣液加乙醇定容至100 mL，搖勻，過濾，棄去初濾液，收集濾液，吸1 mL濾液于試管中，參比管加1 mL無水乙醇。用測定標準工作曲線的方法，測定樣品在550 nm處測定吸光值，見圖2。

圖2 超聲時間對三萜化合物提取率的影響Fig.2 Ultrasonic time on the extraction rate of three terpene compounds

圖2 可以看出隨著時間的增加，其提取率的變化很明顯，提取率先升后降，相同條件下，當超聲處理時間為50 min時，提取效果最好。

3.1.2 不同料液比對三萜化合物提取率的影響

稱取1.0 g的靈芝粉5份，分別于100 mL容量瓶中，分別按料液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 加人 95%乙醇，在60℃條件下，超聲頻率50 Hz，提取時間分別為50 min。提取后，樣液加乙醇定容至100 mL，搖勻，過濾，棄去初濾液，收集濾液，吸1 mL濾液于試管中，參比管加1 mL無水乙醇。用測定標準工作曲線的方法，測定樣品在550 nm處測定吸光值，見圖3。

圖3 料液比對三萜化合物提取率的影響Fig.3 Effects of ratio of material to liquid on the extraction rate of three terpene compounds

圖3 可以看出隨著料液比的增加，其提取率的變化很明顯，提取率先升后降，相同條件下，當料液比為1∶20時，提取效果最好。

3.1.3 不同溫度對三萜化合物提取率的影響

不同溫度對三萜化合物提取率的影響，見圖4。

圖4可以看出隨著提取溫度的增加，其提取率的變化很明顯，提取率先升后降，相同條件下，當處理溫度為50℃時，提取效果最好。

3.2 響應面法優化實驗

圖4 溫度對三萜化合物提取率的影響Fig.4 Effects of temperature on extraction rate of three terpene compounds

根據Box-Benhnken的中心組合設計實驗原理，綜合單因素影響試驗結果，選取超聲溫度、超聲時間、料液比對靈芝三萜提取率的影響，在單因素試驗基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法進行實驗設計[7]，分析因素見下表1所示。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factor and levels of RSM experiment

在單因素試驗基礎上，用上表設計的三因素三水平方式分別進行17組實驗，以提取率為考察指標，確定最佳提取工藝，實驗設計及實驗結果見表2。

建立模型方程與顯著性檢驗應用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行多元回歸擬合分析，得到靈芝總三萜得率與超聲提取各因素變量的二次方程模型為：

提取率（%）=1.27+0.040A+0.023B+0.019C+2.0× 10-3AB+3.25×10-3AC+0.016BC-0.088A2-0.054B2-0.043C2

表2 Box-Benhnken試驗設計方案及影響值Table 2 Program of Box-Behnken experimental design and response value

從表3可以看出，由模型上F值大小可知，三因素對響應值的影響為：A＞B＞C，由P值的大小可以判斷三因素均為極顯著，同時也可看到方程的一次項、二次項、交互項均達到顯著水平，自變量和應變量之間不是簡單的線性關系，說明方程的擬合是較充分的[8]。

模型中F=82.303（P＜0.000 1），失擬項檢驗F=4.828（P=0.081 2＞0.05），溝通無布局說明用上述回歸方程描述各因素之間的關系時，其因變量與全體自變量的線性關系顯著、可靠。可用該模型對靈芝三萜的提取率進行分析和預測。

相應面曲面分析的圖形是特定的響應值對應變量構成的一個三維空間圖，可以直觀地反映此處各自自變量對響應變量的影響，運用軟件分析實驗數據得到響應面圖，分別如下。

表3 回歸方程方差分析結果Table 3 Results of variance analysis for regression equantion

圖5 提取時間與溫度對提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time and temperature on extraction rate

由圖5可以看出在料液比為1∶20時，提取溫度和時間對提取率的交互影響，隨著提取溫度的增加，提取率先升后降，隨著提取時間的增加，提取率也是先升后降，同時可以看出在溫度為50℃，時間為50 min時，交界處附近有極值。

圖6 提取時間與溫度對提取率影響的等高線Fig.6 Contour extraction time and temperature on extraction rate

由圖6的等高線圖可以看出兩者間的交互作用呈現曲線而不是直線，說明兩者之間的交互作用是顯著的。

圖7 料液比與提取溫度對提取率的影響Fig.7 Liquid ratio and extraction temperature on extraction rate

由圖7可以看出在提取時間為50min時，提取溫度和料液比對提取率的交互影響，隨著提取溫度的增加，提取率先升后降，隨著料液比的增加，提取率也是先升后降，同時可以看出在溫度為50℃，料液比為1：20時，交界處附近有極值。

圖8 料液比與提取溫度對提取率影響的等高線Fig.8 The material liquid ratio and extraction temperature on extraction rate of contour

由圖8的等高線圖可以看出兩者間的交互作用呈現曲線而不是直線，說明兩者之間的交互作用是顯著的。

圖9 料液比與提取時間對提取率影響Fig.9 The material liquid ratio and extraction time on the extraction rate of contour

由圖9可以看出在提取溫度為50℃，時，提取時間和料液比對提取率的交互影響，隨著提取時間的增加，提取率先升后降，隨著提取料液比的增加，提取率也是先升后降，同時可以看出在提取時間為50 min時，料液比為1∶20時，交界處附近有極值。

圖10 料液比與提取時間對提取率影響的等高線Fig.10 The ratio of material to liquid and extraction time on the extraction rate of contour

由圖10的等高線圖可以看出兩者間的交互作用呈現曲線而不是直線，說明兩者之間的交互作用是顯著的。

4 結論

對回歸方程求導，并令其等于零，可以得到曲面的最大點，即3個主要因素的最佳水平值，分別為：A=0.00，B=0.00，C=0.00，轉換后得到提取的最佳條件為：提取溫度為50℃，提取時間50 min，料液比為1∶20，預測靈芝三萜提取率為1.27%。通過軟件可看出實際與預測的提取率較為接近，說明該模型適用于靈芝三萜提取工藝的優化。

[1]張曉云,楊春清.靈芝的化學成分和藥理作用國外醫藥[J].植物藥分冊,2006,21(4):152

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