不同品種蘋果果皮和果肉中總三萜含量的測定

李志華，宋曉凱，趙艷敏，劉岱琳，*

（1.中國礦業大學，江蘇徐州221116；2.中國人民武裝警察部隊后勤學院，天津300162）

蘋果中的營養功能因子主要為多酚和三萜類成分[1]。近年來對于蘋果中的多酚類成分的分離及其抗氧化、心腦血管的保護作用等多種功效研究較為深入[2-3]，而蘋果中的三萜類成分研究相對較少。目前在蘋果中已經發現的三萜類化合物有熊果酸，齊墩果酸，薔薇酸，馬斯里酸，科羅索酸等，而熊果酸為蘋果中總三萜的主要成分[4-6]。蘋果中的總三萜有抗癌、抗菌、抗病毒和抗炎等功能[7-9]，目前未見對蘋果中總三萜類成分的含量分析研究。為了全面評價蘋果中的營養成分，比較蘋果不同部位中三萜類成分的分布，本文采用紫外-可見分光光度法，對不同品種蘋果果皮、果肉中總三萜的含量進行了研究。研究結果為蘋果中總三萜營養成分的綜合開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

國產青蘋果、進口青蘋果、黃元帥蘋果、紅蛇蘋果、青蛇蘋果、嘎啦蘋果、棲霞蘋果、姬娜蘋果、花牛蘋果、沂蒙山蘋果、紅富士蘋果、西域皇妃蘋果均為市售產品。

1.2 試劑與儀器

熊果酸對照品、香草醛、無水乙醇、冰乙酸、高氯酸均為分析純；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；ModulyoD凍干機：賽默飛世爾；FA1204B電子天平：上海精科；HH-2數字顯示恒溫水浴鍋：常州市國華儀器有限公司；FW100高速萬能粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備

準確稱取一定量的熊果酸，置于25 mL棕色容量瓶中，加95%乙醇定容，得0.105 mg/mL的熊果酸對照品溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備

將蘋果洗凈、剝皮（厚約1 mm～2 mm），果肉切片，之后快速稱量果肉、果皮的重量（鮮果重），在切片程中為防止酶促褐變將蘋果浸泡在3%檸檬酸溶液中，經冷凍干燥后分別稱重（干果重），后用粉碎機粉碎至100目，真空包裝，放于0℃～4℃冰箱中備用。分別稱取不同品種蘋果果皮、果肉干粉5 g，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加入80 mL 95%乙醇加熱回流提取2 h，冷卻至室溫后用95%乙醇定容至100 mL，搖勻后精確移取10 mL溶液于100 mL容量瓶中，定容即得樣品溶液。

1.3.3 最佳測定波長的選擇

取熊果酸對照品溶液0.6 mL和紅富士蘋果果肉樣品溶液0.2 mL，置于具塞試管中，水浴上蒸干后加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.00 mL高氯酸，于60℃水浴加熱15min后移入冰水浴中冷卻，再加入5.0 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫，15 min后用分光光度計在400 nm～800 nm波長范圍內掃描，確定其最大檢測波長。

1.3.4 顯色條件的選擇

5%香草醛-冰乙酸溶液用量的選擇：取熊果酸對照品溶液0.6 mL 6份，水浴蒸干后分別加5%香草醛-冰乙酸溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，后各加高氯酸1.0 mL，于60℃水浴加熱15 min后移入冰水浴中冷卻，再加入5.0 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫，15 min后于最大吸收波長處測定吸光度，以確定5%香草醛-冰乙酸的最佳用量。

高氯酸用量的選擇：取熊果酸對照品液0.6 mL 6份，水浴蒸干后分別加5%香草醛-冰乙酸溶液0.3 mL，再分別加高氯酸 0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL，于60℃水浴加熱15 min后移入冰水浴中冷卻，再加入5.0 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫，15 min后于最大吸收波長處測定其吸光度，以確定高氯酸的最佳用量。

水浴溫度的選擇：取熊果酸對照品溶液0.6 mL 6份，水浴蒸干后加5%香草醛-冰乙酸溶液0.3 mL、高氯酸 1.0 mL，分別在 40、50、60、70、80、90 ℃水浴中反應15 min，后移入冰水浴中冷卻，再加入5.0 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫，15 min后于最大吸收波長處測定其吸光度，以確定最佳水浴溫度。

水浴時間的選擇：取熊果酸對照品液0.6 mL6份，水浴蒸干后加5%香草醛-冰乙酸溶液0.3 mL、高氯酸1.0mL，于 60℃水浴中分別加熱 5、10、15、20、25、30min，冰水浴中冷卻后加入5.0 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫，15 min后于最大吸收波長處測定其吸光度，以確定最佳水浴時間。

1.3.5 標準曲線的繪制

精密吸取熊果酸對照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，置于具塞試管中，水浴蒸干后分別加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.00 mL高氯酸，于60℃水浴加熱15 min后移入冰水浴中冷卻，再加入5.0 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫，15 min后用分光光度計在最佳檢測波長下測定樣品溶液的吸光度，以熊果酸量（μg）為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.6 總三萜含量的測定

分別吸取上述制備的不同品種蘋果的總三萜試樣溶液0.2 mL，置于具塞試管中，水浴蒸干后加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.00 mL高氯酸，于60℃水浴加熱15 min后移入冰水浴中冷卻，再加入5.0 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫，15 min后用分光光度計在最佳檢測波長下測定樣品溶液的吸光度[10]。根據測得的吸光度和標準曲線回歸方程，計算樣品中的總三萜含量（以熊果酸計）。

1.3.7 分析方法的評價

精密度實驗：精密量取紅富士果肉樣品溶液5份，每份0.2 mL，按照優化條件顯色后測定吸光度，計算結果的相對標準偏差，評價該方法的精密度。

穩定性實驗：精密吸取紅富士果肉樣品溶液0.2mL，按照優化條件，顯色后分別在0～60 min內測定其吸光度，計算結果的相對標準偏差，評價該試驗方法的穩定性。

重現性實驗：稱取相同質量的紅富士果肉干粉5份，按1.3.2項下方法制備樣品溶液，分別取樣品溶液0.2 mL，按1.3.6項下方法進行測定，計算結果的相對標準偏差，評價該方法的重現性。

加樣回收率實驗：在蘋果三萜的樣品液中分別加入不同量的熊果酸標準溶液，分別測定其吸光度，計算總三萜的含量，并計算其回收率。

2 結果與分析

2.1 最佳檢測波長的選擇

按照1.3.3的方法對熊果酸對照品溶液與紅富士蘋果樣品液在400 nm～800 nm波長范圍內進行全波長掃描，結果如圖1、圖2所示。

圖1 熊果酸對照品溶液顯色后全波長掃描譜Fig.1 The wavelength scanogram of ursolic acid after colorable reaction

圖2 紅富士蘋果樣品液加顯色劑顯色后全波長掃描譜Fig.2 The wavelength scanogram of fuji apple sample after colorable reaction

由圖可見，熊果酸對照品溶液和樣品溶液，經過顯色反應后，最大吸收峰均在550 nm左右，因此以550 nm作為最佳檢測波長。

2.2 顯色條件的選擇

按照1.3.4的方法對5%香草醛-冰乙酸用量進行優化，結果表明，隨著香草醛-冰乙酸溶液的增加，吸光度增大，增加到0.3 mL后吸光度開始減小，故選擇0.3 mL作為最佳用量。

對高氯酸用量的優化結果表明，隨著高氯酸用量的增加，吸光度先升高后略有下降，當加入量為1.0 mL時吸光度最大，故選擇1.0 mL作為最佳用量。

對水浴溫度的優化結果表明，隨著溫度升高，吸光度相應增大；但水浴溫度超過60℃時，空白液開始變色，故選擇水浴溫度為60℃。

對水浴時間的優化結果表明，隨水浴時間延長，吸光度增大，15 min以后吸光度基本不變，故選擇水浴反應時間為15 min。

2.3 標準曲線的繪制

以熊果酸量（μg）為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，結果圖3所示。

圖3 熊果酸標準曲線Fig.3 Standard curve of ursolic acid

由圖3可知，熊果酸線性回歸方程為：y=0.007x-0.035（R2=0.999 3），R2=0.999 3，結果表明熊果酸量在21 mg～126 mg范圍內與吸光度線性關系良好。

2.4 分析方法的評價

精密量度實驗：對紅富士果肉樣品5份溶液顯色后進行吸光度測定，結果其吸光度值的RSD為0.87%，表明該測定方法具有良好的精密度，達到了樣品分析要求。

穩定性實驗：對紅富士果肉樣品溶液顯色后分別在0～60 min內進行測定，結果顯示在15 min～40 min內吸光度值穩定，RSD為1.13%和1.76%；表明該方法在顯色后15 min～40 min內完成較為適宜。

重現性實驗：對5份由紅富士果肉制備的樣品溶液顯色后進行測定，計算總三萜的含量，其含量的RSD為1.23%，表明該方法具有良好的重現性。

加樣回收率實驗見表1。

表1 加標回收率實驗結果Table 1 Average recovery for ursolic acid in sample spiked and the RSD

由表1可知，5次加標回收試驗的最低回收率為97.4%，最高回收率為103.78%，平均回收率為100.32%，其相對標準偏差RSD為2.99%。表明該方法準確可靠，此法可用來對蘋果樣品溶液進行總三萜含量檢測。

2.5 樣品測定

取不同品種蘋果制備的樣品溶液，按1.3.5項下方法測定吸光度，每份試樣溶液平行測定3次，由標準曲線和凍干蘋果質量，計算凍干蘋果果皮和果肉中總三萜的含量（以熊果酸計，mg/g），結果見表2。

表2 不同品種蘋果中總三萜含量Table 2 Total triterpenoids contents of diferent apple varieties

2.6 新鮮蘋果果皮和果肉中總三萜的含量

由凍干蘋果中的總三萜含量與凍干蘋果和新鮮蘋果的質量比，即可求得新鮮蘋果中總三萜的含量，結果見表3（Df：凍干果肉占新鮮果肉的比重；Ds：凍干果皮占新鮮果皮的比重）。

表3 不同蘋果品種鮮果中總三萜含量Table 3 Total triterpenoids contents of diferent apple varieties in fresh apple

3 結論

1）采用分光光度法，以熊果酸為對照品，5%香草醛-冰醋酸-高氯酸為顯色反應體系測定不同品種蘋果中總三萜的含量。在5%香草醛-冰醋酸用量0.3 mL、高氯酸1 mL、60℃反應時間15 min，檢測波長為550 nm的條件下，熊果酸量在21 mg～126 mg范圍內與吸光度存在較好的線性關系。

按照優化的顯色條件測得加樣回收平均回收率為100.32%（RSD為2.99%）。該總三萜含量的檢測方法具有操作簡單、穩定性好、精密度高、準確可靠等優點，可用于蘋果中總三萜含量的測定。

2）測定結果顯示同種蘋果的果肉和果皮其總三萜的含量差異較大，不同品種蘋果果皮和果肉中的總三萜含量也存在顯著差異。蘋果果皮中總三萜含量高于果肉中總三萜的含量，本課題組前期測定了不同品種蘋果中多酚的含量[11]，其研究結果也說明蘋果果皮中多酚物質含量較高。這些研究結果都充分說明對于蘋果，盡管果皮量小，但是其所含功能營養成分卻不容忽視。

3）不同品種蘋果果皮的總三萜含量為13.2 mg/g～23.9mg/g，蘋果果肉的總三萜含量為8.0mg/g～15.0mg/g。不同品種蘋果中總三萜含量差異較為明顯，其中以紅蛇果皮中總三萜含量最高，而黃元帥、紅富士和國產青蘋果果皮中含量較低；蘋果果肉中總三萜的含量以嘎啦最高，黃元帥最低。從原料的資源和可獲得性等角度綜合分析，嘎啦蘋果可以作為總三萜類功能性營養成分開發利用的優選品種。

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