液體磁流芯片檢測(cè)牛白血病方法的建立

趙衛(wèi)東，劉偉，王玉玲，劉國紅，鄭文杰

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物和食品檢測(cè)中心，天津300461）

牛白血病（EBL）最初于1878年在德國被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已呈全球性分布，且發(fā)病范圍不斷擴(kuò)大，在某些牛群中血清陽性率高達(dá)60%[1]，中國的安徽、重慶、新疆、江西等地都有發(fā)病的報(bào)道，且感染率較高（10%～50%）。該病病程長(zhǎng)，一般在癥狀出現(xiàn)數(shù)周或數(shù)月后死亡。在歐洲有該病流行的牛群，每年由于本病所導(dǎo)致的死亡率約為2%，也有的高達(dá)5%。該病被認(rèn)為有明顯的家系傾向和免疫抑制性，現(xiàn)已經(jīng)成為影響?zhàn)B牛業(yè)的重要傳染病之一[2-4]。帶有傳染病的奶牛不但會(huì)引起家畜傳染病的爆發(fā)，還會(huì)影響牛奶和奶制品的品質(zhì)。該病是人畜共患病，可經(jīng)牛奶途徑傳染給人類，引起消費(fèi)者尤其是免疫力低下的弱勢(shì)人群發(fā)病。

目前國外對(duì)牛白血病的檢測(cè)主要是采用ELISA方法，已成功研制出基于gp51、p24抗體的檢測(cè)試劑盒[5-6]。國內(nèi)對(duì)牛白血病病毒檢測(cè)方法較少，有過應(yīng)用PCR和PCR-ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道[7-8]，但由于技術(shù)原因，未有成熟的診斷產(chǎn)品出現(xiàn)，主要使用國外進(jìn)口的ELISA試劑盒對(duì)EBL實(shí)施檢疫和市場(chǎng)普查。而對(duì)國外檢測(cè)試劑盒的過分依賴，使我國進(jìn)口牛檢疫和普查工作處于成本高且容易受制的被動(dòng)狀態(tài)。一旦病毒傳入，不僅將直接損害奶牛養(yǎng)殖戶的切身利益，妨礙我國“三農(nóng)”工作的順利進(jìn)行，而且還將威脅我國人民的健康和生命安全。

本研究自主研發(fā)了液體磁流芯片方法，可取代國外試劑盒檢測(cè)方法，用于對(duì)我國進(jìn)口牛和養(yǎng)殖牛EBL的檢疫和普查。

1 材料與方法

1.1 試劑材料與儀器

gp51肽偶聯(lián)免疫磁珠：由天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心實(shí)驗(yàn)室制備并保存于4℃冰箱內(nèi)備用；5%豬血清：豬血清用PBST稀釋到需要濃度；5%羊血清：羊血清用PBST稀釋到需要濃度；5%脫脂乳：準(zhǔn)確稱量5g脫脂乳，溶于90mLPBST溶液中，加熱煮沸，定容至100mL；PBST洗滌液：1000mL10mmol/L pH 7.4的PBS中加入0.5 mL Tween-20；HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG結(jié)合物：購于北京博鰲森生物技術(shù)有限公司。

底物溶液：

A 液：TMB（3、3’、5、5’—四甲基聯(lián)苯胺）200 mg，無水乙醇100 mL，加雙蒸水，至1 000 mL。

B液：（100 mmol/L檸檬酸-200 mmol/L Na2HPO4緩沖液，pH5.0～5.4）：檸檬酸 9.33 g，Na2HPO414.6 g，加三蒸水至1 000 mL，調(diào)pH至5.0～5.4。

臨用前分別取A液、B液各5mL，混勻，加入50μL的30%H2O2。

終止液（2 mol/L H2PO4）：分別取蒸餾水600 mL和濃硫酸100 mL，混勻，定容至900 mL。

移液槍；酶標(biāo)儀：SynergyTM4，美國伯騰儀器有限公司；磁力分離板：天津倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心。

1.2 方法

1.2.1 封閉液及待檢血清最佳稀釋度的確定

吸取100 μL gp51肽偶聯(lián)免疫磁珠于酶標(biāo)板中，放在磁力分離板上，吸棄上層清液。加入不同種類封閉液：5%豬血清、5%脫脂乳，5%羊血清 100 μL/孔，37℃孵育30 min后，放在磁力分離板上，吸棄上層清液，PBST 洗滌磁珠，1 min/次×2；分別加入已做 1 ∶50、1 ∶100、1 ∶200倍稀釋的待檢血清，100 μL/孔，37 ℃孵育30 min，放在磁力分離板上，吸棄上層清液，PBST洗滌磁珠，1 min/次×3。HRP兔抗牛IgG做1∶10 000倍稀釋，37℃孵育 30 min，PBST 洗滌磁珠，1 min/次×3次；加入底物，37℃反應(yīng)10 min后，在酶標(biāo)儀上讀出OD450 值，選擇當(dāng)陽性血清＞0.750，陰性＜0.250 時(shí)，P/N最大的封閉液和血清稀釋度為工作濃度。

1.2.2 HRP兔抗牛IgG最佳工作濃度的確定

吸取100 μL gp51肽偶聯(lián)免疫磁珠于酶標(biāo)板中，放在磁力分離板上，吸棄上層清液，加入最佳封閉液，封閉結(jié)束后，放在磁力分離板上，吸棄上層清液，加入最適稀釋度的血清，37℃孵育30 min，放在磁力分離板上，吸棄上層清液，PBST洗滌磁珠后，分別加入按1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000倍比稀釋的 HRP 兔抗牛IgG，37℃孵育 30 min，PBST 洗滌磁珠，1 min/次×3次；加入底物A、B液，37℃反應(yīng)10 min后，在酶標(biāo)儀上讀出OD450值。選擇當(dāng)陽性血清＞0.750，陰性血清＜0.200時(shí)，P/N最大的抗體稀釋度為工作濃度。

1.2.3 與相關(guān)檢測(cè)方法的對(duì)比分析

Svanova公司BLV gp51-Ab試劑盒法，實(shí)驗(yàn)步驟見試劑盒說明書。

本實(shí)驗(yàn)方法：吸取100 μL gp51肽偶聯(lián)免疫磁珠于酶標(biāo)板中，放在磁力分離板上，吸棄上層清液。加入5%豬血清封閉液100 μL/孔，37℃孵育30 min后，放在磁力分離板上，吸棄上層清液，PBST洗滌磁珠，1 min/次×2；分別加入已做1∶50倍稀釋的待檢血清，100 μL/孔，37 ℃孵育 30 min，放在磁力分離板上，吸棄上層清液，PBST 洗滌磁珠，1 min/次×3；HRP 兔抗牛IgG做1∶10 000倍稀釋，37℃孵育30 min，PBST洗滌磁珠，1 min/次×3次；分別加入底物 A、B 液，37℃反應(yīng)10 min后，在酶標(biāo)儀上讀出OD450值。

2 結(jié)果分析

2.1 不同血清稀釋度及封閉液ELISA結(jié)果

選取三種封閉液：5%豬血清、5%羊血清、5%脫脂乳，待檢牛血清按 1 ∶50、1∶100、1∶200 倍比稀釋，與封閉液組成方陣，按照以上步驟進(jìn)行ELISA，結(jié)果見表1。

表1 不同血清稀釋度及封閉液ELISA結(jié)果Table 1 Results of different serum samples and blocking solutions

從表1中可看出，用5%豬血清或5%的脫脂乳做封閉液，隨血清稀釋度的增加陽性血清及陰性血清OD450值顯著下降，同一血清稀釋度下，用5%豬血清或5%的脫脂乳封閉，陽性血清OD450大致相同，陰性血清OD450：5%豬血清＜5%的脫脂乳。5%脫脂乳封閉時(shí)，陽性血清OD450值明顯低于5%豬血清或5%的脫脂乳封閉，陰性血清OD450值大致相同。故羊血清的封閉效果不如豬血清或脫脂乳，而豬血清對(duì)陰性血清的封閉作用優(yōu)于脫脂乳。不同封閉條件下的P/N：5%豬血清＞5%脫脂乳＞5%羊血清。因此，得到符合條件的組合為：5%豬血清封閉，血清1∶50倍稀釋。

2.2 不同兔抗牛IgG稀釋度ELISA結(jié)果

采用5%豬血清封閉，待檢血清做1∶50倍比稀釋，把HRP兔抗牛IgG分別做1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000倍稀釋，按照以上步驟進(jìn)行ELISA，結(jié)果見表2。

表2 不同兔抗牛IgG稀釋度ELISA結(jié)果Table 2 Results of different HRP-labeled rabbit anti-cow IgG

本實(shí)驗(yàn)的判定方法為：當(dāng)血清的OD值＞0.750時(shí)判斷為陽性，血清OD值＜0.250時(shí)判斷為陰性，若有疑似血清，判斷P/N值，當(dāng)P/N值≥3時(shí)判斷為陽性，P/N值＜3時(shí)判斷為陰性。

2.3 Svanova公司BLV gp51-Ab試劑盒與本實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)牛血清結(jié)果

選取41份牛血清，分別采用國外Svanova試劑盒和本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果，見表3和表4。

表3 BLV gp51-Ab試劑盒檢測(cè)血清結(jié)果Table 3 Results of BLV gp51-Ab kit to serum

根據(jù)試劑盒說明，當(dāng)PP≥15時(shí)，判斷為陽性，當(dāng)PP＜15時(shí)，判斷為陰性。由表3中我們可以看出陽性血清為 6 份，血清編號(hào)分別為 0091，0247，0026，0113，0141，0138。陰性血清為35份。

表4 液體磁流芯片法檢測(cè)血清結(jié)果Table 4 Results of magnetic fluid chip method to serum

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)方法，當(dāng)OD值＞0.750時(shí)判斷為陽性，當(dāng)OD值＜0.250時(shí)，判斷為陰性。由表4可知，檢出陽性血清 6 份，分別為 0091，0247，0026，0113，0141，0138。其中，疑似血清為3972，3278，0171，進(jìn)一步采用P/N值法判定，血清3278和3972的P/N值＜3，判斷為陰性；血清0171的P/N值＞3，判斷為陽性。Svanova公司BLV試劑盒檢測(cè)出的陽性血清本實(shí)驗(yàn)方法均檢測(cè)出來。BLV試劑盒檢測(cè)血清0171為陰性，而本實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)為陽性。兩種方法檢測(cè)到的陽性血清符合率100%，陰性血清符合率為97.5%。我們可以判定此方法可用于牛白血病病毒的檢測(cè)。

表5 與Svanova試劑盒檢測(cè)結(jié)果的比較Table 5 The result comparation of magnetic fluid chip method and BLV gp51-Ab kit

3 結(jié)論與討論

牛白血病病毒是引起EBL的一種外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒。該病毒感染牛后，牛體內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白抗囊膜糖蛋白抗原gp51可對(duì)其產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)對(duì)gp51蛋白表位的分析預(yù)測(cè)和磁珠偶聯(lián)技術(shù)，制備了gp51肽偶聯(lián)免疫磁珠，通過對(duì)封閉液、血清稀釋濃度和HRP兔抗牛IgG工作濃度的篩選和優(yōu)化，建立了針對(duì)牛白血病的液體磁流芯片檢測(cè)方法。本方法可同時(shí)對(duì)40個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)時(shí)間為2 h～3 h，通過與Svanova公司gp51-Ab試劑盒進(jìn)行測(cè)定比較，表明2種方法檢測(cè)到的陽性血清符合率為100%，陰性血清符合率為97.1%。因此，本方法可完全替代國外試劑盒檢測(cè)方法，降低檢測(cè)費(fèi)用，擺脫了長(zhǎng)期對(duì)國外試劑盒的依賴。

在研究過程中，主要采用移液槍、磁力架等簡(jiǎn)單設(shè)備及手工操作，因操作人員及手法熟練程度的差異，初期常出現(xiàn)洗滌過程中偶聯(lián)磁珠部分流失的問題，出現(xiàn)部分孔結(jié)果重復(fù)性不好的問題，需要對(duì)操作人員進(jìn)行短期的技術(shù)及操作要領(lǐng)培訓(xùn)。如果采用自動(dòng)化的磁流洗滌設(shè)備，可明顯減少誤差，進(jìn)一步提高檢測(cè)準(zhǔn)確率和重復(fù)性。

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