shRNA-PTTG對A549肺癌細胞株生物學功能的影響

張泳 王建華 李迎春

shRNA-PTTG對A549肺癌細胞株生物學功能的影響

張泳 王建華 李迎春

目的 探討shRNA-PTTG對肺癌A549細胞生物學功能的影響。方法 采用shRNA技術沉默PTTG蛋白的表達，使用western blot與RT-PCR檢測沉默效率，使用western blot檢測沉默PTTG后VEGF蛋白的表達影響，使用MTT檢測細胞增殖，使用流式細胞儀檢測周期。結果 western blot與PCR結果顯示shRNA成功沉默PTTG蛋白的表達，且VEGF表達明顯下降，MTT結果顯示沉默PTTG后，細胞生長明顯收到抑制，流式細胞儀結果顯示，沉默PTTG后G2-M期明顯延緩。結論 PTTG基因具有促進肺癌A549細胞株增殖的作用，且可能是通過VEGF而發揮作用。

PTTG；VEGF；肺癌；增殖

肺癌是當今世界上對人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤之一。世界上許多國家和地區肺癌的發病率和死亡率都有所增加，今后30年內肺癌將成為中國居民的主要死亡原因[1]。目前,肺癌患者的5年生存率為10%[2]，非小細胞肺癌早期確診手術切除率低，對放化療均不太敏感，因此針對該腫瘤的生物學和基因療法尤為重要。研究PTTG在肺癌中的表達對于進一步了解非小細胞肺癌的發生、浸潤和轉移機制，探討新的有效治療方法具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 小量質粒提取試劑盒為中鼎試劑公司產品。Lipofectamine2000購自Invitrogen公司。編碼針對PTTG的shRNA由上海吉瑪生物工程技術有限公司合成。RNA提取試劑盒及RT-PCR試劑盒為TaKaRa公司產品。一抗分別為兔抗人PTTG抗體，兔抗人VEGF抗體，B-actin抗體購自博奧森生物工程有限公司，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體為北京中山金橋。

1.2 細胞培養與轉染 人肺癌細胞株A549（上海細胞生物學研究所），采用DMEM培養基、10%胎牛血清、37℃、5%CO，的條件下培養。針對人PTTG的shRNA質粒的構建委托上海吉瑪生物有限公司合成確定三條shRNA-PTTG以及一條NC對照組。嚴格按照lipofectamine2000（Invitrogen公司）試劑說明說進行細胞的轉染，取對數生長期的細胞，接種于6孔板或96孔板內，待細胞達到85%～90%的融合，按照質粒：轉染試劑比例為4μg∶6μL分別加入質粒與轉染試劑進行細胞轉染，6h后換上新鮮的培養液，24h后查看轉染效率，轉染48h后進行后續檢測。

1.3 western blot檢測VEGF蛋白表達 取轉染效率達較高的細胞，提取細胞蛋白，定量，置于-20%保存，每樣品取15μL加入等體積loading buffer，于聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濃縮膠電壓80V，分離膠電壓120V，電泳時間約1h。半干轉移法，恒流轉移2h；電轉移后的PVDF膜用依次進行脫脂奶粉封閉，在一抗四度過夜（PTTG與VEGF稀釋比例為

1∶200和1∶100），PBST溶液洗膜，二抗室溫孵育2h（稀釋比例為1∶1000），暗房中用ECL溶液顯色，壓片，顯影。

1.4 RT-PCR檢測PTTG mRNA表達 根據PTTG序列在Qiagen公司設計其特異性引物，收集轉染48h后的A549肺癌細胞，按Trizol操作說明書提取細胞總RNA，按照RT—PCR試劑盒說明書檢測PTT GmRNA含量。取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統掃描鑒定。

1.5 MTT測細胞增殖 將實驗共分為5組，無質粒陰性對照組，PTTG-shRNA-NC，PTTG-shRNA-1，PTTG-shRNA-2，PTTG-shRNA,3，每組設置5復孔，每孔5×103個細胞接種于96孔培養板中。培養24,48,72h后每孔加入0.5g/L的MTT，孵育4h后，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO)溶解結晶，選擇波長490nm吸光度讀取數值，時間為橫軸，吸光度值為縱軸繪制細胞生長曲線。重復3次。

1.6 流式細胞儀檢測細胞周期 A549細胞轉染48h候，取

2×106個細胞，PBS洗滌，70%冰乙醇固定，加入500μg/mL的碘化丙啶(PI)和10mg/mLRNA酶A，37℃避光染色30min，流式細胞儀檢測，分別計算出G0/G1期、S期細胞所占的百分比。每組重復實驗3次。

1.7 統計學方法 所有數據采用SPSS18.0統計學軟件進行處理，正態計量資料采用t檢驗分析RT-PCR、westemblot，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 shRNA-PTTG在體外A549細胞中可以明顯降低PTTG蛋白與VEGF蛋白的表達 RT-PCR檢測后發現

shRNA-PTTG-1，shRNA-PTTG-2，shRNA-PTTG-3轉染組中PTTG 蛋白的表達明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見圖1）；western blot檢測后發現shRNAPTTG-1，shRNA-PTTG-2，shRNA-PTTG-3轉染組中PTTG蛋白的表達明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見圖2）。表明構建的shRNA-PTTG質粒成功，可有效降低PTTG在肺癌A549細胞中mRNA水平與蛋白水平的表達。而PTTG被沉默后其靶基因VEGF蛋白的表達明顯下降。提示PTTG可能是通過VEGF而發揮作用（見圖1）。

圖1 sh-RNA-PTTG對A549細胞內PTTG蛋白以及VEGF蛋白的影響

2.2 shRNA-PTTG對肺癌細胞株A549細胞增殖的影響MTT結果顯示shRNA-PTTG-1，-2，-3組A549肺癌細胞增殖與對照組相比明顯降低，細胞生長明顯收到抑制，差異有統計學意義（P＜0.05，見圖2）。

圖2 shRNA-PTTG對AS49細胞增值的影響

2.3 shRNA-PTTG對細胞周期的影響 流式細胞儀結果顯示shRNA-PTTG組A549肺癌細胞與其對照組相比G2-M明顯延緩，且差異具有統計學意義，而S期與G0-G1未見顯著差異（見表1）。

表1 shRNA-PTTG對細胞周期的影響

3 討論

PTTG是Pei[3]等于1997年采用PCR方法分離出的一種新型原癌基因。該課題組將轉染PTTG基因的成纖維細胞種植于無胸腺裸鼠皮下后，發現其于3周后形成腫瘤，因而將這一基因定名為垂體瘤轉化基因。在隨后的研究中，Zhang[4]等發現PTTG基因(hPTTG)定位于染色體的5q33區，并且含有603個堿基對組成的開放閱讀框，編碼產生一個26KD的蛋白。隨著越來越多的基因研究發現，PTTG在人類多種惡性腫瘤的發生發展中發揮著重要的作用。

腫瘤是一種細胞周期，凋亡等因素發生紊亂的一種惡性程度極高的疾病，其根本原因在于細胞的正性因子表達增強或負性因子表達減弱，導致細胞過度生長、分裂，出現細胞生長失控。新近研究表明PTTG可能為一種腫瘤轉化基因，它可以通過多條途徑而誘導腫瘤的發生、發展，并且這種作用在沒有其他基因輔助時也存在，可能單獨發揮作用[5]。研究發現，PTTG具有刺激細胞有絲分裂因子和血管生長因子的分泌與表達，從而可以通過促進血管的生成而促進腫瘤細胞的增殖作用。Zhang等[4]在研究垂體腺瘤時發現PTTG mRNA表達水平顯著升高，且其在分泌型腫瘤中，侵犯蝶竇者PTTG表達水平明顯高于未侵犯者。更有研究報道[6-7]，在112例垂體瘤標本的檢測中發現PTTG與VEGF的mRNA水平和PTTG，VEGF蛋白水平以及KDF/ FIK-I mRNA及其蛋白在垂體腫瘤中的表達量明顯高于其在正常垂體組織的表達。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和血管內皮生長因子(VEGF)是調節血管生成的重要因子Heaney等[8]在表達小鼠的GH細胞中發現bFGF的表達水平在24h內增加了240%，并且PTTG mRNA與bFGF的最高水平同時出現，而加入bFGF抗體時，PTrG mRNA的水平又降低了。這似乎表明PTI'G和bFGF之間存在正反饋的調節機制。而本研究中發現在沉默PTTG后其A549肺癌細胞株中的VEGF表達亦降低[9]。更提示了PTTG基因可能調節血管生成生長因子的表達，從而擾亂腫瘤組織及其間質內的血管生成平衡，啟動血管生成機制，促進腫瘤的生長和侵襲等。隨著研究的深入，在轉染PTI'G的人胚腎細胞、子宮平滑肌瘤、甲狀腺癌等中發現FGF、VEGF的水平與PTTG呈劑量依賴性增高[10]。

MTT實驗結果顯示，在PTTG基因沉默后，A549細胞生長和存活能力受到明顯的影響，細胞活力產生了巨大的交化。這可能是由于PTTG激活脯氨酸的增殖基因C-myc，而其在調控細胞的增生中發揮著關鍵作用。在酵母和哺乳動物細胞中，PTTG表達蛋白與異源性DNA結合區融合后，其酸性羧基末端具有反式激活作用。蛋白激酶級聯的活化可增強PTTG蛋自反式作用。而MAPK又可通過51-54氨基酸間的SH3結合位點與PTTG直接作用。MAPK磷酸化及MEKI與PTTG相互作用不僅能增強PTTG反式激活功能，也能促進PTTG表達蛋自移位于核內激活原癌基因生長因子從而促進腫瘤生長[11]。

綜上所述，沉默PTTG基因在A549肺癌細胞中的表達后其下游基因VEGF的表達明顯下降，A549肺癌細胞株的增殖明顯收到抑制，且使A549肺癌細胞停滯在G2-M期，從而達到抑制腫瘤細胞生長的作用。

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Objective To explore the biological functions of shRNA - PTTG on A549 lung cancer cell. Methods The shRNA technology used to silence the expression of PTTG protein，and then using western blot and rt-pcr detection efficiency; The western blot was also used to detect the expression of VEGF protein after PTTG silenced. MTT was used to detect cell proliferation and using flow cytometry instrument testing cycle. Results Western blot and PCR showed that shRNA success silence the expression of PTTG protein and the expression of VEGF was decreased obviously. MTT and flow cytometry results showed that A549 cell growth is suppressed obviously and G2 -m period significantly down shifting after PTTG silence. Conclusion PTTG gene can promote the proliferation of A549 cell lines, and VEGF may be play a role in this procession.

PTTG; VEGF; Lung cancer; Proliferation

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.20.001

陜西省教育廳專項科研項目（2010JK505）

陜西 712000 陜西中醫學院附屬醫院外三科 （張泳 王建華）710054 解放軍323醫院護理部（李迎春）