胰腺癌細胞TM4SF1的表達及其對細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響

曹佳 李磊 賀思佳 金晶 吳洪玉 徐雷鳴 李兆申

TM4SF1(transmembrane 4 L six family member 1, 也稱L6,L6-Ag)是4次跨膜蛋白L6超家族成員[1]，在一些上皮來源的腫瘤，如肺癌、卵巢癌、腎癌、前列腺癌等有異常高表達[2-5]。Kao等[6]報道，TM4SF1表達量與肺鱗癌患者的生存期呈正相關。Gordon等[7]報道，TM4SF1/PKM2和TM4SF1/ARHGDIA兩組比值與惡性胸膜間皮瘤的術后預后相關。本課題組在前期實驗中應用基因芯片對胰腺癌細胞株的mRNA進行篩查，發現絕大多數胰腺癌細胞株的TM4SF1 mRNA表達高于人正常胰腺導管細胞(human pancreatic duct epithelial，HPDE)，提示TM4SF1基因可能與胰腺癌的發生、發展有關[8]。本研究旨在進一步觀察TM4SF1對胰腺癌細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響。

材料與方法

一、細胞株及實驗材料

MPanc96、MiaPaCa-2、HPAC、PANC1、AsPC-1胰腺癌細胞系購自ATCC(American Type Culture Collection)。HPDE細胞株由多倫多大學Tsao博士贈送。MPanc96、MiaPaCa-2、PANC1及AsPC-1細胞株均在含10%胎牛血清、1%抗生素的DMEM培養液中培養、傳代；HPAC細胞株在含10%胎牛血清、1%抗生素的RPMI培養液中培養、傳代；HPDE細胞株在含牛垂體抽提物及上皮生長因子 的無血清角化細胞培養液中培養、傳代。靶向TM4SF1基因的siRNA(siTM4SF1)及陰性對照siRNA(siNC)均購自QIAgen公司，siTM4SF1序列為5′-AAGGACCACTATGTCTTGATT-3′。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自美國QIAgen公司。

二、細胞TM4SF1 mRNA表達的檢測

三、胰腺癌細胞TM4SF1基因表達的沉默

選取2株高表達的胰腺癌細胞株MPanc96、MiaPaCa-2 的對數生長期細胞，分別接種于10 cm的培養皿中，密度為50%～60%，置37℃培養箱內孵育1 h。在2個EP管中分別加入200 μl OPTI MEM、80 μl Hiperfect、8 μl siRNA(10 μmol/L的siTM4SF1或siNC)混勻，放置室溫30 min后分別逐滴滴入孵育1 h的細胞內，繼續孵育24 h。應用qRT-PCR方法驗證瞬時轉染效果。

四、胰腺癌細胞增殖檢測

取轉染的對數生長期細胞，采用Promega公司的細胞增殖檢測試劑盒進行檢測。將已轉染并孵育24 h的細胞用胰酶消化，用含2%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞密度為1.5×104/ml，接種于96孔板，每孔100 μl。轉染siNC及siTM4SF1的細胞均接種4排，每排6個復孔。4排分別在培養0、24、48、72 h時每孔加入15 μl四唑化合物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt, MTS]，繼續培養1 h，應用lQuant通用型96孔板分光光度計進行讀數。上述實驗重復3次，取均值。

五、細胞遷移與侵襲力檢測

采用裝有Polycarbonate膜的Transwell小室檢測細胞的遷移力。取轉染24 h的細胞，用無血清的DMEM液調整其密度為2×105/ml。下室加入650 μl含2%胎牛血清的DMEM，上室接種100 μl轉染細胞，37℃培養箱內孵育16～24 h。用棉簽蘸清水擦去膜上層面的細胞，甲醇固定5 min，Hematoxylin染色3 min。鏡下取8個視野計數穿膜細胞數，計算轉染siTM4SF1的細胞穿膜數量較轉染siNC 細胞穿膜數量減少的百分比。實驗重復3次，取均值。

采用裝Matrigel包被膜的Transwell小室檢測細胞的侵襲力。在上室及下室分別加入500 μl無血清DMEM液后置4℃過夜，棄培養液。上室加100 μl上述的轉染細胞，下室加650 μl含2%胎牛血清的DMEM液。以下步驟同細胞遷移力的檢測。

六、統計學處理

應用Graphpad Prism軟件進行統計分析。采用Mann-WhitneyU檢驗及Dunnett′s Multiple comparison檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、各細胞株TM4SF1 mRNA的表達

HPDE細胞TM4SF1 mRNA表達量為0.020±0.003，胰腺癌MPanc96、MiaPaCa-2、PANC1、AsPC-1、HPAC細胞的表達量分別為1.205±0.073、1.096±0.260、1.382±0.075、1.374±0.363、0.744±0.096，均顯著高于HPDE的表達量(F=22.26，P<0.01)。

轉染siTM4SF1的MPanc96細胞TM4SF1mRNA表達量為0.150±0.049，轉染siNC的細胞為0.924±0.162，前者的表達量下降了83.8%；轉染siTM4SF1的MiaPaCa-2細胞TM4SF1 mRNA表達量為0.206±0.038，轉染siNC的細胞為0.878±0.119，表達量下降了76.5%，表明TM4SF1基因的表達被顯著沉默。

二、TM4SF1基因沉默對MPanc96、MiaPaCa-2細胞增殖的影響

轉染siTM4SF1的MPanc96、MiaPaCa-2細胞的增殖與轉染siNC的MPanc96、MiaPaCa-2細胞的增殖差異均無統計學意義(U值均=6.000，P值均=0.686，圖1)。

圖1 轉染的MPanc96(上)、MiaPaCa-2細胞(下)的增殖曲線

三、TM4SF1基因沉默對MPanc96、MiaPaCa-2細胞遷移及侵襲力的影響

轉染siTM4SF1的MPanc96細胞的遷移力較轉染siNC的MPanc96細胞下降(62.5±7.6)%，侵襲力下降(69.5±5.7)%；轉染siTM4SF1的MiaPaCa-2細胞的遷移力較轉染siNC的MiaPaCa-2細胞下降(72.8±4.0)%，侵襲力下降(78.6±6.3)%(圖2、3)。

圖2 轉染siNC(左)和siTM4SF1(右)的MPanc96(上)、MiaPaCa-2(下)穿膜細胞(遷移力實驗， ×200)

圖3 轉染siNC(左)和siTM4SF1(右)的MPanc96(上)、MiaPaCa-2(下)穿膜細胞(侵襲力實驗， ×200)

討 論

1986年HellstromI等[2]應用10 000種單克隆抗體雜交肺癌小鼠的脾臟組織，從而發現其中14種為肺癌特異性抗體，其中的一種抗原按照當時的編號命名為L6，同時發現這L6在乳腺癌及結腸癌中也有異常表達。Marken等[9]研究發現L6是含有4次跨膜結構的膜蛋白，認為L6可能屬于4次跨膜蛋白(Tetraspanins)家族。Wright等[1]發現L6及另外3種4次跨膜蛋白家族的成員，它們與家族其他成員相比雖具有相似的拓撲結構，但缺乏高度保守的CCG(Cys-Cys-GLy)序列，因此將它們從4次跨膜蛋白家族中細化出來，命名為4次跨膜蛋白L6超家族，L6蛋白也就被命名為TM4SF1。TM4SF1相對分子質量約21 000，由202個氨基酸組成。此后在一些上皮來源的腫瘤，如卵巢癌、腎癌、前列腺癌等中均發現有TM4SF1的異常高表達[3-5]。2001年Storim等[10]發現TM4SF1影響表皮角質細胞的體外遷移功能。Chang等[11]報道，TM4SF1與CD13(aminopeptidase N)相互作用，這種作用可能與肺癌細胞侵襲前蛋白改變相關。

本研究結果顯示，胰腺癌細胞的TM4SF1mRNA表達水平明顯高于正常人胰腺導管上皮細胞。證實了前期基因芯片檢測的胰腺癌細胞TM4SF1表達增加的結果，提示TM4SF1基因可能與胰腺癌的發生、發展有相關性。應用RNA干擾技術沉默胰腺癌細胞MPanc96、MiaPaCa-2的TM4SF1基因表達，結果顯示TM4SF1基因沉默后MPanc96、MiaPaCa-2細胞的增殖能力無顯著變化，但細胞的體外遷移及侵襲力顯著下降，推測TM4SF1與胰腺癌的侵襲、轉移相關。本研究組將建立胰腺癌原位移植瘤動物模型，通過體內實驗進一步驗證TM4SF1對胰腺癌細胞遷移及侵襲能力的影響。

參 考 文 獻

[1] Wright MD, Ni J, Rudy GB. The L6 membrane proteins——a new four-transmembrane superfamily[J]. Protein Sci, 2000, 9(8):1594-1600.

[2] Hellstr?m I, Horn D, Linsley P, et al. Monoclonal mouse antibodies raised against human lung carcinoma[J]. Cancer Res, 1986, 46(8):3917-3923.

[3] Hellstr?m I, Beaumier PL, Hellstr?m KE. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1986, 83(18):7059-7063.

[4] Svensson HP, Frank IS, Berry KK, et al. Therapeutic effects of monoclonal antibody-beta-lactamase conjugates in combination with a nitrogen mustard anticancer prodrug in models of human renal cell carcinoma[J]. J Med Chem, 1998, 41(9):1507-1512.

[5] O′Donnell RT, DeNardo SJ, Shi XB, et al. L6 monoclonal antibody binds prostate cancer[J]. Prostate, 1998, 37(2):91-97.

[6] Kao YR, Shih JY, Wen WC, et al. Tumor-associated antigen L6 and the invasion of human lung cancer cells[J]. Clin Cancer Res, 2003, 9(7):2807-2816.

[7] Gordon GJ, Dong L, Yeap BY, et al. Four-gene expression ratio test for survival in patients undergoing surgery for mesothelioma[J]. J Natl Cancer Inst, 2009, 101(9):678-686.

[8] Logsdon CD, Simeone DM, Binkley C, et al. Molecular profiling of pancreatic ademocarcinoma and chronic pancreatitis identifies multiple genes differentidly regulated in pancreatic cancer[J]. Cancer Res, 2003,63:2649-2657.

[9] Marken JS, Schieven GL, Hellstr?m I, et al. Cloning and expression of the tumor-associated antigen L6[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992, 89(8):3503-3807.

[10] Storim J, Friedl P, Schaefer BM, et al. Molecular and functional characterization of the four-transmembrane molecule l6 in epidermal keratinocytes[J]. Exp Cell Res, 2001, 267(2):233-242.

[11] Chang YW, Chen SC, Cheng EC, et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells[J]. Int J Cancer, 2005, 116(2):243-252.